Merhabalar, değerli okurlar bu yazımda sizlere agaroz jel elektroforezi ile ilgili rahatlıkla uygulayabileceğiniz bir deney protokolünden bahsetmek istiyorum. Hangi konsantrasyonda jel hazırlanacağı jelde yürütülecek DNA molekülünün içerdiği baz miktarı ile ters orantılı olarak değişmektedir eğer yüksek miktarda baz içeren bir DNA molekülünü ayrıştırmak istiyorsanız agaroz jel konsantrasyonunuzu düşük tutmalısınız böylece düşük konsantrasyonlu jel hazırladığınızda jeldeki por genişlikleri daha büyük olacağından büyük DNA molekülleri birbirlerinden daha kolay ayrıştırılır ama jel konsantrasyonu arttıkça daha küçük DNA molekülleri birbirlerinden ayrıştırılır.
DENEY MALZEMELERİ
1) Agaroz jel sistemi
2) Güç kaynağı
3) Agaroz
4) Etidiyum bromür
5) 100 ml’lik Erlenmayer
6) Para film
7) Mikrodalga fırın
8) 1X 100 ml TAE tampon çözelti
9) DNA loading dye
10) DNA Ladder
11) DNA örneği
12) PCR ependrof tüpü
DENEYİN YAPILIŞI
1) Öncelikle istenilen konsantrasyon belirlenir ve hassas terazi kullanılarak agaroz tartılır ve erlenmayer içine konulur. Örneğin %0.8’lik bir jel hazırlayacaksanız 0.8 gram agaroz tartılır ve içinde 100 ml TAE tapon çözelti bulunan erlenmayer içine yerleştirilir. Erlenmayerin ağzı para film ile kapatılıp para film üzeri hafifçe delinir ve mikrodalga fırında 2-3 dakika ısıtılarak tüm agaroz jelin tampon içinde tamamen çözünmesi sağlanır.
2) Jelin döküleceği jel kabı alt ve üst taraftan plastik tıpalar ile iyice kapatılır ve düz bir yere konulur ve fırından çıkarılan jel biraz soğumaya bırakılır ve içerisine 3-5 mikrolitre Etidiyum bromür eklenir bu aşamadan sonra çok dikkat edilmelidir çünkü etidiyum bromür çok toksik bir kimyasaldır. Jel çok fazla bekletilmemeli çünkü 45 derecenin altında agaroz jelleşerek katılaşır ama jel kabına çok sıcakta dökülmemelidir. Jel kaba dökülmeden önce jelde kuyucuklar elde etmek için jel kabının baş kısmına uygun büyüklükteki jel tarağı konulur ve jel kaba dökülür. Jel dökülürken kabarcıklar oluşmamasına çok dikkat edilmelidir eğer oluşursa da bir küçük pipet ucu yardımıyla yok edilmelidir. Jel yaklaşık 1 saat bekletilir ve iyice katılaşması sağlanır bu arada jel kabı asla yerinden hareket ettirilmemelidir.
3) Jel tamamen katılaştıktan sonra jel kabının alt ve üst tarafındaki plastik tıpalar çıkarılır ve jel kabı direk jel tankına konulur ve jelin üstünü tamamen örtecek şekilde jel hazırlamada hangi tampon kullanıldı ise onunla doldurulur ve jelin kuyucukları jel tankının negatif kutbuna gelmelidir.
4) 1 ul loading dye ve 5 ul DNA örneği PCR tüpünde karıştırılır ve jelin kuyucuklarına otomatik pipet yardımıyla aktarılır ve bu aşamada jelin kuyucuklarının pipet ucu tarafından yırtılmamasına dikkat edilmelidir ve sol en baş kuyucuğada 5 ul DNA ladder konulur ve tankın ağzı kapatılır ve güç kaynağına bağlanır ve jel tankındaki iki kutup arasındaki uzunluğa göre uzunluk başına 5 volt uygulanır ve yaklaşık yarım saat ile 1 saat jelin yürütülmesi sağlanır. Jel bitince agaroz jel tanktan ve kabının içerisinden dikkatli bir şekilde çıkarılır ve parçalanmamasına dikkat edilir. UV ışık yardımı ile jeldeki DNA molekülleri kontrol edilir. Jel tankındaki çözelti de ayrı bir kaba aktarılır ve jel ile çalışma bitince ayrı özel bir kaba atılması gerekir çünkü etidiyum bromür çok toksik bir kimyasaldır. Agaroz sistemi de laboratuvarda ayrı bir yerde bulunması gerekir ve o bölgede sürekli çift kat eldiven ile çalışılması gerekir agarozun tüm atıkları ayrı toplanıp tıbbi atık konteynırlarına atılmalıdır.
Ferhat ÖCAL