Agaroz Jel Elektroforez Analizi

Bu yazımda siz değerli araştırmacılara agaroz jel elektroforez analizinin temel özelliklerinden ve bir sonraki yazımda ise bu analizin deney protokolünden sizlere bahsedeceğim. Agaroz jel elektroforezi genetik mühendisliğinde ve moleküler biyoloji alanında kullanılan en temel tekniklerden biridir ve çeşitli amaçlar için kullanılır. Bunlar;

• DNA veya RNA molekülünün restriksiyon enzimleri ile muamelesi sonucu oluşan parçaların incelenmesi.
• İzole edilmiş olan DNA veya RNA moleküllerinin saflığının ve bütünlüğünün korunup korunmadığının incelenmesi.
• PCR(polimeraz zincir reaksiyonu) sonucu çoğaltılan DNA molekülünün doğru çoğaltılıp çoğaltılmadığının kontrol edilmesi.
• İzole edilen veya PCR reaksiyonu ile çoğaltılan DNA moleküllerinin büyüklüklerinin(kaç nükleotid içerdiği) ve miktarlarının belirlenmesi
• PCR ile çoğaltılmış veya izole edilmiş olan DNA moleküllerinin jelde yürütülüp safsızlıklardan uzaklaştırılması sağlanarak tekrar jelden ilgili DNA molekülünün izole edilmesi

gibi çeşitli alanlarda kullanılmaktadır ve genetik alanında kullanılan en kolay, en hızlı tekniklerden biridir.

Agaroz Jel Elektroforezine Etkki Eden Faktörler

Agaroz jel analizinde jelde yürütülecek olan DNA veya RNA molekülünün hareketine çeşitli faktörler etki etmektedir.

• Agaroz konsantrasyonu

Temel olarak DNA ve RNA molekülleri negatif yüklüdür ve jel tankında negatif elektrottan pozitif elektrota doğru hareket ederek birbirlerinden moleküler ağırlıklarına göre ayrışırlar.

Jelde ağır moleküller yavaş hafif moleküller ise daha hızlı hareket ederler bunun sebebi de agarozun konsantrasyonudur. Genel kural olarak Konsantrasyon artıkça moleküller daha yavaş ama konsantrasyon azaldıkça daha hızlı hareket ederler.

Agaroz deniz yosunlarından ekstrakte edilen 12.000 kDa ağırlığındaki lineer bir çeşit polisakkarittir. Jelde yürütülecek ve ayrıştırılacak DNA veya RNA molekülünün ağırlığına göre agaroz konsantrasyonu belirlenir. Eğer yüksek ağırlıklı molekül ayrıştırılacak ise agaroz konsantrasyonunun düşük eğer düşük ağırlıklı molekül ayrıştırılacaksa agaroz konsantrasyonunun yüksek olması gerekir. Bu durumun temel nedeni agaroz jelin konsantrasyonu arttıkça yapısındaki porlar küçülür ve daha küçük molekülleri tutması sağlanır ve küçük moleküller daha iyi haraket ederek birbirlerinden ayrılır ama agaroz konsantrasyonu azaldıkça yapısındaki porlar genişler ve böylece daha büyük moleküllerin geçmesi ilerlemesi sağlanarak birbirlerinden ayrılması sağlanır bu nedenle molekülün ağırlığı ile agaroz konsantrasyonu ters orantılı olarak çalışır ve yüksek konsantrasyonlu agaroz küçük molekülleri düşük konsantrasyonlu agaroz ise büyük moleküllerin birbirlerinden daha iyi ayrıştırılmasını sağlar. Genelde yüksek ağırlıklı moleküller %0.7 veya %0.8 konsantrasyonlu agaroz jelde düşük ağırlıklı moleküller ise %1.0 veya %1.5 konsantrasyonlu jelde daha iyi ayrıştırılması sağlanır.

• Voltaj

Jele uygulanan voltaj arttırıldığında moleküllerin daha hızlı hareket etmesi sağlanır fakat voltaj artışı elektronların hızlı hareketinden dolayı beraberinde ortamdaki ısınında artmasına sebep olacağından jelde çeşitli hasarların oluşmasına sebebiyet verir ve jelin erimesine sebep olarak DNA veya RNA molekülünün kaybedilmesine sebep olur. Bundan dolayı jelde uygulanacak voltaj cm başına 5 voltu geçmemelidir. Burada jel tankındaki iki elektrot arasındaki mesafe cm cinsinden ölçülür ve cm başına 5 volt uygulanır kesinlikle jelin uzunluğuna göre belirlenmez.

• Elektroforez tampon çözeltisi

Jel elektroforezinde elektrik iletkenliğinin sağlanabilmesi için çeşitli tampon çözeltiler kullanılır bunlar;

1. TAE (Tris Acetate EDTA): içerisinde tris bazı asetat iyonu ve EDTA içeren bir tampon çözelti
2. TBE (Tris Borate EDTA): içerisinde tris baz borat iyonu ve EDTA içeren bir tampon çözelti
3. TPE (Tris Phosphate EDTA): içerisinde tris bazı fosfat iyonu ve EDTA içeren tampon çözelti

Bu tampon çözeltiler içerisinde en çok TAE tampon çözeltisi kullanılmaktadır fakat TBE veya TPE tampon çözeltilerinin elektrik iletkenlikleri TAE tamponundan daha fazla olmasına rağmen jelde fazla miktarda ısı oluşumuna sebep oldukları için özel durumlar dışında kullanılmamaktadır. Çünkü TBE ve TPE  tamponlarının iyonik kuvvetleri(içerdikleri iyonların özellikleri) çok yüksektir ve hızlı iyon hareketinden dolayı ortamda fazladan ısı oluştururlar ve buda jelin erimesine sebep olur. Bunun yanı sıra hazırlanan tampon 10X konsantrasyonunda hazırlanır fakat jel tankında 1X’lik konsantrasyondaki hali kullanılır çünkü eğer 10X konsantrasyonundaki çözelti kullanılırsa yüksek miktarda iyon içerdiği için ortamda çok yüksek ısılar oluşturarak jelin erimesine sebep olur yada yukarıdaki tamponlardan birinin yerine sadece su kullanılırsa hiçbir şekilde DNA veya RNA moleküllerinin ayrıştırılması sağlanamaz çünkü su yeterli iyonik kuvvete sahip olmadığı için elektrik akımı jel boyunca iletilemez.

İyonik kuvvet açısından TPE TBE den TBE de TAE den daha iyidir bundan dolayı DNA veya RNA molekülleri TPE de daha hızlı TAE de daha yavaş ilerler fakat genel olarak TAE tamponunun kullanımı yeterli ve iyi sonuç verir.

• Etidiyum Bromür

Etidiyum bromür molekülü bir floresan boyadır ve DNA molekülünün iplikleri arasına girerek jel bittikten sonra DNA molekülünün UV ışık altında bantlar halinde kolay bir şekilde görüntülenmesini sağlar ve böylece molekülün sağlamlığı, boyutu ve miktarı rahat bir şekilde belirlenir. Fakat etidiyum bromür son derece kanserojen ve mutajen bir ajandır bundan dolayı kullanılırken son derece dikkatli olunması gerekir.

 

Önemli Notlar;

– Eğer plazmit DNA(Halka şeklindeki DNA molekülü) jelde yürütülürse 3 bant görülür ve en üsteki bantta tek zinciri kırık plazmit yer alır orta kısımda lineer hale gelmiş plazmit en aşşağıda ise yuvarlak(süperkoild) plazmit yer alır.

– Eğer total RNA izole edilip jelde yürütülürse yine üç bant görülür ve yukarıdan aşağıya doru sırasıyla rRNA, mRNA ve tRNA yer alır yani en üstte rRNA ortada mRNA altta ise tRNA yer alır.

– Jelde DNA ve RNA yürütülüp görüntülendiğinde keskin bir şekilde bantlar görünmesi gerekir (yani tek bir çizgi gibi) eğer silik sürüntü şeklinde görüntü oluşmuşsa buradan ilgili DNA veya RNA molekülünün degrede olduğu yani yapısının bozulduğu anlaşılır.

– Jel elektroforezinde tamponlar hazırlanırken konsantrasyonlarına içeriklerine ayrıca jel tankına konulan tamponun türüne ve konsantrasyonlarına çok dikkat edilmesi gerekir.

– Agaroz jelde yumak halindeki DNA(süperkoild DNA) lineer DNA molekülünden daha hızlı hareket eder çünkü porlardan daha rahat ve hızlı geçer.

– En önemli noktalardan biriside jel tankına hangi tampon çözelti konulacaksa agaroz jelinde tanka konulan tampon çözelti kullanılarak hazırlanması gerekir. Eğer tanktaki tampon ile agaroz için kullanılan tamponlar farklı olursa sorunlar oluşur veya agaroz tampon çözelti yerine su ile hazırlanırsa hiçbir sonuç alınamaz.

 

Ferhat ÖCAL

 

Kaynaklar;

1. Abant Izzet Baysal University Molecular Genetics Laboratory Manual