PCR Çeşitleri

Şevval ÇAKIR

5 yıl önce

PCR Nedir?

PCR Metodu basitçe, nükleik asitlerin uygun koşullarda tüpte çoğaltılması şeklinde tanımlanmaktadır. Spesifik bir DNA parçasının kopyalarının primerler tarafından önlendirilerek enzimatik olarak sentezlenmesi şeklinde tanımlanan in vitro ( canlı dışında, tüpte ) bir yöntemdir.

Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerini tamamlayıcı bir çift sentetik oligonükleotid primer kullanılarak, bu iki primerlerle sınırlandırılan genin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır.

PCR’ın Kullanım Alanları;

Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı,
Prenatal tanıda;
Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanmasında,
Adli tıpta,
Onkogenesisin araştırılmasında,
Klonlamada, gen tanısı araştırmalarında,
Nokta mutasyonlarının belirlenmesinde,
DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında,
Bilinmeyen dizi tayinlerinde,
İn vitro fertilization yapılan tek hücrede, implanasyon öncesi genetik testlerin yapılmasında,
DNA-Protein interaksiyonunun araştırılmasında vb. kullanılmaktadır.

PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile çalışmaya olanak sağlamaktadır. PCR tekniği ile laboratuvar tanısında çok büyük bir hız ve kesinlik kazanılmış; bir çok durumda radyoaktivite kullanımını gereksiz hale getirmiştir.

PCR Çeşitleri

Multipleks PCR;

İki veya daha fazla farklı PCR amplifikasyonunun aynı reaksiyonda gerçekleştirilmesi işlemine dayanmaktadır. Klasik PCR ile aynı basamaklarda gerçekleşir ancak çoklu primer setleri kullanılmaktadır. Hedef DNA’nın farklı segmentleri ayrıştırılabilmektedir. İnternal kontrol gerektiren çalışmalarda kullanılabilir. Bir örnekte bulunan değişik ajanlara ait DNA’lar aynı tüpte aynı anda çoğaltılabilir. İnternal olarak birde fazla bölgenin çalışılmasının gerektiği durumlarda kullanılmaktadır.

Multipleks PCR’da primer setleri kullanılmaktadır. Bu setler amplikon denen amplifikasyon ürünlerini oluştururlar. Çoklu genlerin çalışılmasında ilk önce tekli test yapıp diziler ile ilgili ön bilgiye sahip olunması gerekmektedir. Aksi halde daha çok reaktif ve daha fazla uygulama gerektirir.

Primerler dikkatli bir şekilde seçilmelidir. Primer bağlanma sıcaklarının birbirlerine uyumlu olması gerekmektedir. Primerlerin birbirleri ile dimerizasyona girmemesi gerekmektedir.

Yuvalanmış ( Nested ) PCR;

Özgün olmayan ürünlerin oluşumunu engelleyen, yüksek özgünlükte bir PCR yöntemidir.

Bu yöntemde ardarda 2 PCR yapılmaktadır. İlk PCR özgün olmayan ürünlerin oluşumuyla sonuçlanır. 2. PCR ise ilk PCR sonucu çoğaltılmış DNA’nın iç kısımlarına ait dizileri içeren ‘’NESTED’’ primerleri ile yapılmaktadır. İlk PCR ürünleri 2. PCR için kalıp olarak kullanılmaktadır ve istenilen hedef bölge çoğaltılarak özgün ürünler elde edilmektedir. Bu sayede Özgül olmayan amplifikasyonlar önlenmiş olmaktadır.

Demirlenmiş ( Anchored ) PCR;

Çoğaltılacak olan DNA’nın sadece bir bölgesinin bilindiği durumda uygulanmaktadır.

Bilien bölgeden yararlanılarak ilgilenilen DNA parçasının çoğaltılması işlemine dayanmaktadır.

Çoğaltılacak DNA bilinen bir diziye bağlanır ve bu dizi 2. Primer bölgesi olarak kullanılmaktadır.

Geri ( Revers ) Transkripsiyon PCR;

RNA PCR olarak da adlandırılan RT-PCR, iki aşamalı olup RNA’dan tamamlayıcı DNA sentezi ( geri transkripsiyon) ve tamamlayıcı DNA’nın da standart PCR yoluyla çoğaltılması aşamalarına dayanmaktadır.

htermophilus DNA polimerazı gibi bazı polimerazlar mangan varlığında hem RNA hem de dNA kalıp ipliklerini kullanabildiğinden tüm işlem aynı tüpte tek aşamada yapılabilmektedir. RT-PCR, mRNA veya viral RNA miktarlarının belirlenmesi ild RNA düzeyinde gen anlatımı çalışmalarında oldukça duyarlı bir yöntemdir. Aynı zamanda ‘’ Message amplification phenotyping- MAPPing ‘’ olarak da bilinen bu yöntem az sayıdaki hücreden aynı anda fazla miktarda RNA’nın analizinide mümkün kılar.Ayrıca RNA PCR, hücresel bir RNA örneğindeki tüm RNA’lardan PCR yoluyla cDNA kitaplıklarının oluşturulması içinde yararlı bir yöntemdir.

Değişik ters transkripsiyon enzimleri bulunmaktadır. MMLV enzimi RNA da bulunan ikincil yapıları aşamaz. SS III (Superscript) RNA da bulunan ikincil yapıları açarak senteze devam edebilir.

Ters ( İnvers ) PCR;

Bilinen bir DNA dizisinden yararlanılarak bu DNA’nın her iki ucundaki bilinmeyen bölgelerin çoğaltılması için kullanılır.

Bilinen diziyi içeren DNA önce restriksiyon enzim kesimi ile doğrusal ve sonra bilinen DNA’yı içerecek şekilde halkasal hale getirilmektedir. Ardından bilinen DNA dizilerine ikinci bir restriksiyon kesimi uygulamasıyla tekrar doğrusal olarak elde edilen DNA molekülü bilinen dizilere uygun olarak tasarlanan primerler yardımı ile çoğaltılır.

Asimetrik PCR;

Asimetrik PCR yöntemi, fazla miktarda çoğaltılan tek iplikli ürünün dizilenmesi için kullanılmaktadır. Bu PCR çeşidinde, kullanılan iki primerden biri miktarca diğerinden çok daha fazladır. Bu nedenle asimetrik PCR sonucu ipliklerden biri diğerinden çok daha fazla miktarda artar.

Asimetrik PCR herhangi bir kalıp ipliğe uygulanabilir ancak tek iplikli ürünün fazla miktarda üretilememesi gibi bir sorunla karşılaşılabilmektedir. Bu nedenle çoğunlukla klasik PCR ile önce çift iplikli hedef DNA çoğaltılır, ardından simetrik PCR uygulamasıyla kalıp yeniden çoğaltılarak tek iplikli ürün yeterli miktarda üretilebilmektedir.

In Situ PCR;

Lam üzerindeki hücre, doku ya da doku parçaları içindeki kalıp DNA’nın PCR ile çoğaltılması işlemidir. Bu yöntem viral DNA’nın ve tek kopyalı genlerin saptanmasında veya RT-PCR ile birlikte viral RNA ve transkriptlerin belirlenmesinde kullanılmaktadır.

İn situ PCR, hücre içine PCR bileşenlerinin girişine izin vermek üzere hücre membranları yarı geçirgen hale getirildikten sonra fikse edilmiş hücre veya dokularda kullanılmaktadır.

Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA ( Rapd );

Bu PCR metodu, dizisi bilinmeyen DNA parçalarınn çoğaltılması için kullanılmaktadır. Reaksiyon ürünleri, oligonükleotidlerin dizisine, uzunluğuna ve reaksiyon şartlarına bağlıdır. RAPD yönteminin en büyük üstünlüğü ise çok sayıda marker sağlamasıdır.

İmmuno PCR;

PCR ile antijen saptama sistemidir. Özgül olarak antijen-antikor kompleksine bağlanmış bir işaret DNA parçasının çoğaltılması için kullanılmaktadır.

Hot Start PCR;

PCR’ın ilk aşamasında özgül olmayan amplifikasyonları azaltmayı amaçlayan bir yöntemdir

Hot Start PCR düşük sıcaklıklarda Taq polimerazı inaktive ederek özgül olmayan bağlanmaların engellenebildiği bir PCR yöntemidir. Bu Metotda; Örnekler (çift zincirli DNA) kendi denatürasyon sıcaklığında denatüre edilir ve sıcaklık aniden 55

Dereceye düşürülüp primer ve Taq polimeraz eklenir.

Real Time PCR;

Real-Time PCR’da ürünlerin analizi reaksiyon sırasında yapılmaktadır. Bu nedenle, agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarının mor ötesi ışık altında görüntülenmesi gibi işlemlerin uygulanmasına gerek kalmamaktadır. Real-Time PCR ürünlerinin kalitatif ve kantitatif analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan boyalardan ya da diziye özgün problardan yararlanılmaktadır.

Real-Time PCR Reaksiyon esnasında her bir PCR siklusunda yeterli miktarda ürünün verdiği floresans ışığa göre çalışıp reaksiyonu aşama aşama sonuna kadar oluşan ürünü kontrol eden bir sistemdir.