PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) DNA çoğaltılması işlemidir. Bu mekanizma 1985 yılında Carry Mullis tarafından tanımlanmış ve günümüze kadar birçok defa modifiye edilerek kullanılmaya devam edilmiştir.
PCR yapmaktaki amaç yüksek ısıda zarar görmeyen DNA’daki özgün bölgelerin polimeraz yardımı ile çoğaltılmasını sağlamaktır. Genetik hastalıkların tanısı, nokta mutasyonların, delesyon ve duplikasyonların analizi, babalık testleri ve maternal kontaminasyon gibi birçok moleküler biyoloji ve genetik testlerde kullanılmaktadır.
PCR yapabilmek için Termal Cycle (Isı Döngü) cihazı kullanılır. Bu cihazın mantığı; İçerisine mikrotüpler ile konulan (DNA+enzim+primer gibi) PCR ürünlerinin değişik ısılara maruz bırakılarak DNA’daki çoğaltılmak istenen bölgeler ile primerlerdeki bölgelerin bağlanması ve çoğalmasını sağlamaktır. Ayrıca üst kapağındaki yüksek ısı sayesinde içerisine konulan ürünlerin buharlaşmasını engeller.
Klasik PCR 3 aşamadan oluşmaktadır. Bunlar;
1- Denatürasyon(Bozundurma),
2- Annealing (Bağlanma),
3- Elongasyon (Uzama),
Bu aşamaları detaylı olarak inceleyecek olursak.
1- Denatürasyon (Bozundurma);
Çift zincirli olan DNA yapısının yüksek ısı yardımıyla birbirinden ayılması aşamasıdır.
Çoğunlukla DNA’lar 94-98 °C’de 15 sn ile 10 dk. arasında denatüre edilebilinir.
2-Annealing (Bağlanma);
Denatürasyondan sonraki aşama olan annealing aşamasında; tek zincir olarak açılmış olan DNA’ların üzerinde kendi eşlenikleri olan bölgelere daha düşük sıcaklıkta bağlanırlar. Ortalama annealing ısısı 45-70 °C’de 30 sn ile 2,5 dk. arasında değişmektedir.
Eğer ki bağlanması istenilen bölgede GC oranı yüksek tekrar bölgelerinden oluşuyorsa annealing ısısı 70 °C’ye kadar artırılabilir.
3-Elongasyon (Uzama);
PCR’ın son aşamasıdır. Genellikle 72°C’de enzimin bağlanmış olan özgül bölgesinin uzatıldığı aşamadır.
PCR Reaksiyonu bileşenleri:
- Reaksiyon tamponu
- DNA
- Primerler (Forward+Reverse)
- Nükleotidler
- Polimeraz
- MgCl2
PCR Nasıl Çalışır ?
- Çift Zincirin birbirinden ayrılması (94-98 °C)
- Primerlerin hedef bölgelere bağlanması (45-70 °C)
- Bağlanan bölgelerin uzaması (72°C)
PCR Çalışma Gradienti
Jel Elektroforez Yöntemi
PCR işleminde hedef bölge ile DNA’nın bağlandığını, Jel Elektroforez Yöntemi ile anlarız.
Buradaki amaç; Yüklü partiküllerin bir elektrik akımı ile ayrılmalarını sağlamaktır. Kısaca açıklamak gerekirse bir tampon çözelti içerisinde PCR yapılmış örnek floresan boya içeren boya ile boyanır ve boya DNA’lara yapışarak elektrik akımı ile ayrılıp UV lamba ışığında ışıma yapar. Bu ışıma DNA ile bağlanmaya çalışılan hedef bölgenin (primerlerin) boyu (kbp) ile orantılı olarak değişir. Işımanın şiddeti ölçülerek analiz gerçekleştirilir.
Jel elektroforez sistemi detaylı anlatımı için “Agaroz Jel Elektroforezi (PCR sonrası DNA örneklerinde)” yazımızı okuyabilirsiniz.
Yazar: Ömer Cihangir TAŞKAN
Tarih: 30 Eylül 2018
Linkedin Profili : https://www.linkedin.com/in/cihangirtaskan/