Proteinlerin Top Down ve Bottom Up Analizi-Giriş (Nicel Görüşlere Odaklanmak)
Proteom araştırmalarının temel odak noktası, protein ekspresyonunda ki değişikliklerin ve bunların modifikasyonlarının belirlenmesidir.
Proteomik biliminin ilk yıllarında kullanılan başlıca teknik 2 boyutlu poliakrilamid jel elektroforez (2D-PAGE) yöntemiydi. Bu yaklaşım proteinlerdeki diferansiyel haritaları ortaya çıkardı. Bu farklılaşan noktaların ayrıntılı analizleri kütle spektrometrisinin kullanımı ile mümkün olmuştur. 2D-PAGE yönteminin yeniden üretilebilirliği oldukça zordur. Protein alt kümelerinde bir çok sınırlama (Hidrofobik, çok bazik, çok büyük veya çok küçük proteinler) bulunduğu için otomatize edilememiştir.
Proteinlerin nicelendirilmesi, genellikle, farklı proteinlerle farklı sinyal yoğunlukları gösteren bir kaç boyama yöntemini takiben görüntü analizi ile gerçekleştirilir. Bu yöntemin dinamik algılama aralığı büyük çoğunlukla yüksek yoğunluğa sahip proteinlerde iyi sonuçlar verir. Ayrıca, prensip olarak görüntü analizi proteomların karmaşıklığına bağlı olarak tek bir noktada bulunan protein karışımları hakkında detaylı bilgi veremez. Son olarak, jel matrisindeki proteinin enzimatik bölünmesi, düşük peptit geri kazanımına maruz kalmıştır.
Bütün bu kısıtlamalar, kütle spektrometrisi uzmanlarını proteom analizleri için alternatif analiz stratejileri geliştirmeye teşvik etti. İlk yıllarda Kütle Spektroskopisi (MS) küçük molekül çalışmalarında kullanıldı. Bu nedenle, enzimatik olarak bir proteomun heterojen ve kaba protein karmaşıklığını küçük peptidlere bölerek analiz etme yolu tercih edildi. Enzimatik parçalama ile proteomun karmaşık yapısı enzimatik olarak çok boyutlu kromatografik ayırmalar ve kütle spektrometresi için hidrofobiklik, çeşitlilik ve erişilebilirliğe ilişkin çok daha elverişli özelliklere sahip daha küçük peptidlere dönüştürülmüş olur. Bu gelişmeye paralel kısa süre içerisinde kütle spektrometrisi, bilişim ve protein veritabanları ile birlikte geliştirilmiş ve karmaşık peptid karışımlarını işlemek üzere optimize edilmiş, yüksek verimli MS-MS ile peptidin tanımlanmasına olanak sağlamıştır.
Proteom araştırmasının temeli, ‘bottom up ‘ veya ‘ shotgun’ proteomik adı verilen bu yolu takip etti. Ne yazık ki, buttom up yaklaşımı birkaç ciddi ve temel sınırlamaya da sahiptir. Birincisi, proteomu peptidlere bölmek suretiyle karmaşıklık 40 kat artar ve yüzbinlerce peptid üretilir. Bu en modern kütle spektrometrisinde bile problem oluşturan bir sayıdır.
Sonuç olarak, bu peptidlerin sadece bir kısmı detaylı olarak analiz edilebilir (‘alt hesaplama etkisi’) ve belirli proteinlerin miktarlarındaki niceliksel bir dalgalanmayı çözmek için gerekli olan her bir numuneden aynı peptidlerin analiz edildiğinden emin olmak zordur. İkinci ve daha da ciddi olan, bir protein ve türevlendirilmiş peptidlerin içeriği yok edilir. Belli bir peptid, post-translasyonel modifiye edilmiş, işlenmiş veya kesilmiş protein türleri gibi farklı proteinlerden veya belirli bir gen ürününün farklı formlarından veya eklenme varyantları veya protein isoformları gibi ortak ana amino asit sekansı uzantılarına sahip olan proteinlerden türetilebilir. Tek bir gen neredeyse aynı peptit parçalarından oluşan çokluğu tahmin edilemeyecek kadar ( onlarca hatta yüzlerce) farklı protein türlerini üretebilir. Sonuç olarak, bir peptitin kantitatif analizi, bu belirli peptidi ihtiva eden tüm proteinlerin toplamını izler. Ne yazık ki, hangi protein türlerinin belli bir proteom durumunda eksprese edildiği bilinememektedir. Proteom analizinde sekans kapsamı genellikle % 50’den daha düşük olduğundan çeşitlilik veya modifikasyonların eksikliğini giderme ihtimali oldukça yüksektir. Sonuç olarak, “buttom up” bir yaklaşımla belirlenen peptidin miktarı mutlak olarak ilgili proteininin miktarını yansıtmaz. Bu protein bazlı yani “top down” yaklaşımda tamamen farklıdır. Bozulmamış bir proteinin doğası ve moleküler yapısı molekül kütlesi gibi moleküler özelliklerle tanımlanmaktadır. Örneğin; tek bir proteinin bir lizinden sonra bir bölünme ile işlendiği iki proteom durumu karşılaştırıldığında, 2D-PAGE veya hatta 1D-PAGE gibi protein bazlı (top down) bir analizde kolayca görülür. Bununla birlikte, “buttom up” bir yaklaşımla, iki durumda tüm peptidler tam olarak aynı görünür ve biyolojik fark saptanamaz. Bu belirgin sınırlamalara rağmen “buttom up” yaklaşımlar sıklıkla kullanılmaktadır. İlgili tekniğin basitliği ve peptit temelli yaklaşımlara yönelik muazzam gelişim ayrıştırma ve kütle spektrometresi tarafında proteomik alanını ağırlıklı olarak buttom up yaklaşımları uygulamaya zorladı. Bununla birlikte, son yıllarda post-translasyonel modifikasyonların (PTM) neden olduğu protein çeşitliliğinin önemi, bozulmalar ve işleme olayları proteom bilim adamları için belirgin hale gelmiştir.
Yinede mevcutta devam eden büyük teknik engellerin kaldırılması gerekiyor. Ancak top down proteomik yaklaşımların potansiyeli ve avantajları hakkında farkındalık önemli ölçüde artmaktadır.
Kaynak : Protein and Peptide Analysis by LC–MS Experimental Strategies (With a Foreword by Neil L. Kelleher)