Proteomik Analizlerinde Kullanılan Tipik Proteazlar
Proteazlar, amino asitler arasındaki peptit bağlarının hidrolizini gerçekleştiren tüm organizmalarda evrensel olarak bulunan enzimlerdir. Bu şekilde, protein sıralama ve geri dönüşüm, hücre döngüsü ilerlemesi, hücre farklılaşması ve göçü, doku morfogenezi ve yeniden şekillendirme, nöronal büyüme, hemostaz, yara iyileşmesi, bağışıklık, anjiyogenez ve apoptoz dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerde yer alırlar. Proteolizin önemi, kanser, artrit, progeria ve nörodejeneratif ve kardiyovasküler hastalıklar da dahil olmak üzere proteaz fonksiyonundaki değişikliklerle ilişkili çeşitli patolojik koşullarda da görülmektedir.
Proteazlar yakın zamana kadar sadece protein bozucuları olarak biliniyordu, günümüzde ki proteaz yaklaşımı; substratlarının durumunu geri dönüşümsüz bir şekilde değiştirerek, proteazlar diğer proteinlerin işlevini aktive edebilir, etkisizleştirebilir veya düzenekleyebilir ve böylece moleküler sinyalleri dönüştürebilir.
Son zamanlarda ‘proteaz ağı‘ terimi, kompleks ağı ve çapraz-konuşmayı birbirine bağlı proteazları, inhibitörlerini ve substratlarını tanımlamak için sunulmuştur ve diğer PTM’lerle birlikte proteomu şekillendirmektedir. Fizyolojik rollerinin yanı sıra, proteazlar, farmasötik ve tıbbi araştırmalarda, gıda, deri ve deterjan endüstrisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, deri işleme, et yumuşatma, peynir aroması geliştirme, ipek degumming ve çamaşır deterjanları için pazarlanan serin proteazlar kullanılmaktadır. Tıbbi uygulamalı proteaz örnekleri sırasıyla dermal bozukluklara, kan pıhtılaşma bozukluklarına ve damar işlevine yardımcı olan kolajenaz, ürokinaz ve brinazdır. Enzim Komisyonu (EC) sınıflamasına göre, proteazlar 3.4 alt grubuna (peptid bağlarında etkili olan hidrolazlar) aittirler ve endopeptidazlara ve exopeptidazlara ayrılırlar. Endopeptidazlar, bir proteinin polipeptit zinciri içinde substratlarını parçalarken, öpeptidazlar amino asitleri protein N veya C terminusundan çıkarır ve böylece sırasıyla aminopeptidazlar veya karboksipeptidazlar olarak adlandırılır. Proteazın sınıflandırılması, katalitik mekanizması, özgüllüğü ve sıcaklık ve pH optima gibi diğer özellikleri temel alınarak yapılır. Bilinen bir çok proteaz için, aktif bölgedeki nükleofıl, genellikle, bir metal iyonuna bağlı bir sistein, serin, aspartik asit, glutamik asit, treonin, asparagin veya sudur. Aktif bölge ayrıca proteaz türünü ve onun katalitik mekanizmasını tanımlar. Substrat spesifitesi, proteazlar arasında büyük farklılık gösteren başka bir farklılaşma faktörüdür ve aktif bölge bölünmesinin yanı sıra, eksositler tarafından da belirlenebilir.
Protein sindirimi tipik kütle spektrometresi (MS) temelli bottom-up proteomiği deneyinde önemli bir unsur oluşturmaktadır. Günümüze kadar ağırlıklı olarak protein sindirimi yüksek özgünlüğü, yaygınlığı ve kullanım kolaylığı nedeniyle tripsin ile gerçekleştirilmiştir. Buna alternatif bir çok proteaz bulunmasına karşılık günümüzde de en çok tercih edilen proteaz tripsindir. Proteazların kütle tabanlı proteomiks çalışmalarında da kullanımı oldukça yaygındır. Şu anda proteomikte kullanılan proteazların repertuarı, yavaş yavaş tripsin ile beraber veya tripsinden farklı proteazlar ilede gerçekleştirilebiliyor. Ancak bu proteazlar yine de bir düzineden daha azıyla sınırlıdır. Aşağıda ki tabloda proteazların başlıca özellikleri özetlenmiştir.
| Proteaz | Gen Ailesi | Parçalama Noktası |
Kullanım Amacı |
| ArgC | Cysteine protease | R’nin C-terminali | ArgC, çoğunlukla PTM’leri araştırmak ve proteom kapsamını niteliksel olarak arttırmak için diğer proteazlarla birleştirilir. |
| AspN | Metalloprotease | D’nin N-terminali | AspN, D artıklarının amin tarafındaki peptid bağlarının hidrolizini gerçekleştirebilir. Ayrıca 4-9 arasındaki bir pH aralığında işlev görür. |
| Chymotrypsin | Serine protease | F, Y, L, W ve M bölgelerinin C-terminali | Bir kimotripsin sindiriminden üretilen peptidler, hem nitel hem de nicel olarak tripsinin ortogonal olan bir proteom boşluğunu kaplarlar. Hidrofobik amino asitler tercih sebebiyle, kimotripsin membran proteinlerinin transmembran bölgelerinin kaplanmasında özellikle yararlıdır. |
| GluC | Serine protease | D’nin C-terminali | GluC, PTM’lerin çalışılması ve proteom kapsamını niteliksel olarak arttırmak için diğer proteazlarla kombine edilebilir. |
| LysargiNasea16 | Metalloprotease | R and K bölgelerinin N-terminali | Özgüllüğü, tripsini, R ve K kalıntılarının N-terminal tarafında yararak aynalamaktadır. C proteini terminden türemiş peptitlerin tanımlanmasını sağlar. Aksi halde, bunlar tripsin sindiriminden sonra tanımlanamazlar. |
| LysC | Serine protease | K’nın C-terminali | Çok etkili ve spesifiktir.
Genellikle, seri bir LysC> tripsin sindirim protokolünde tripsin’i tamamlayan ve tripsinin K kalıntılarına doğru daha düşük verimliliğini tamamlamak için kullanılır. LysC, denatürantlara karşı dirençlidir (8 M üre gibi). Bu, proteinlerin sindirim etkinliğini arttıran en iyi denatüre edilmiş halde sindirilmesini sağlar. |
| LysN | Metalloprotease | K’nın N-terminali | LysN denatürantlara karşı tripsin’den daha dayanıklıdır.
Ayrıca 70 ° C’ye kadar ısıtılabilir. LysN’nin ETD peptid parçalanması ile kombinasyonu benzersiz ve doğrudan sekans yorumlaması sağlar ve kolay nazik dizilemeyi sağlar. |
| Pepsina16 | Aspartic protease | Y, F and W’nin C-terminali | Pepsin, düşük bir pH’da geniş özgüllük ve yüksek aktivite sergilediğinden, MS ile disülfür bağı belirlemek için tercih edilen enzimdir. Düşük pH’da proteinlerin sindirimi disülfid değişimini ortadan kaldırır. Pepsin, düşük sıcaklık (4 ° C) ve pH (2.5) ‘de aktif kalır ve bu durum, döteryumun hidrojene geri dönüşümünü önlediği için LC-MS / MS kullanılarak hidrojen / döteryum değişim deneyleri için şarttır. |
| Trypsin | Serine protease | R and K’nın C-terminali | Tripsin nispeten makul bir maliyetle bulunabilir ve çok verimli, spesifiktir. Bottom-up proteomik için altın standarttır. |
| WaLP and MaLPa15 | Serine protease | Alifatik aminoasitlerin C-terminali | Bu α-litik proteazlar, alifatik artıklara spesifiktir. Bu, onları zar protein dizilerinin incelenmesi için özellikle değerli kılar. |
Kaynaklar :
and Proteomics beyond trypsin; Biomolecular Mass Spectrometry and Proteomics Bijvoet Centre for Biomolecular Research and Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, University of Utrecht, Netherlands Proteomics Center, The Netherlands
2-Piero Giansanti, Liana Tsiatsiani, Teck Yew Low & Albert J R Heck (2016). Six alternative proteases for mass spectrometry–based proteomics beyond trypsin.