Bazen nükleik asit ölçümü olarak bilinen RNA ve DNA ölçümü, belirli bir numunedeki RNA veya DNA konsantrasyonunu belirler. Miktar belirleme işleminin bir kısmı, potansiyel olarak proteinler, diğer nükleik asitler veya organik bileşikler gibi birden fazla kirletici madde içeren karışım olan numunelerin işlenmesini içerebilir.
RNA ölçümü nedir?
RNA ölçümü için çeşitli deneysel yöntemler mevcuttur. Bunlar, RNA ölçümü, floresan veya spektrofotometrik ölçümler için PCR yöntemlerini içerir.
RNA ölçümü için spektrofotometrik ve floresans yöntemlerinin , PCR gibi yaklaşımlara göre çeşitli avantajları vardır. Optik yöntemlerle RNA ölçümü yapmak herhangi bir ek numune hazırlama gerektirmez, çok uygun maliyetlidir ve daha az zaman alır. PCR tabanlı yaklaşımlar iyi hassasiyet sunabilse de, daha karmaşık ve gerçekleştirmeleri maliyetlidir ve bu hassasiyet düzeyi yalnızca en düşük RNA konsantrasyonlarının RNA ölçümü için gereklidir.
Spektrofotometri ve Florometrik Analiz
Spektrofotometrik ölçümler, RNA ölçümü için sağlam ve basit bir yol sunar. RNA ölçümü tipik olarak 260 nm’de gerçekleştirilir ve UV aralığında bir dizi dalga boyu da toplanır. Çoğu protein, küçük organik molekül ve nükleik asit türü, bu bölgede güçlü absorpsiyon ve emisyon özelliklerine sahiptir, bu da RNA miktarının belirlenmesine ve potansiyel kontaminantların tanımlanmasına olanak tanır.
Bilinen bir yol uzunluğunda ölçülen bir numunenin absorbansı, o numunenin konsantrasyonu ile orantılıdır. Numuneden belirli bir dalga boyunda (RNA için 260 nm) iletilen ışık miktarı, Beer-Lambert denkleminde ilgilenilen numunenin konsantrasyonunu hesaplamak için, bu durumda RNA ölçümü için kullanılabilir. İlgili türün molar absorpsiyon katsayısı da bilinmelidir.
Molar soğurma katsayısını hesaplamak nispeten basittir. Belirli bir dalga boyunda absorbans ve yol uzunluğu arasındaki ilişki konsantrasyonla doğrusal orantılı olduğundan, bir referans numunenin bir dizi belirli dilüsyonları ölçülebilir. Bu veri noktalarına doğrusal bir uyum kullanılarak, molar absorpsiyon katsayısı hesaplanabilir ve gelecekteki ölçümlerde kullanılabilir. DNA ve RNA gibi iyi karakterize edilmiş numuneler için katsayılar bilinir ve analiz yazılımına dahil edilir.
RNA Sayımı, floresan ölçümleriyle de gerçekleştirilebilir . Floresans ölçümleri, absorbans bazlı ölçümlerden daha fazla hassasiyet sunar. İlgili analiti spesifik olarak uyarmak için geliştirilmiş test kitleri mevcuttur. Bunlar, karmaşık karışımlarda veya kirleticilerin varlığında bile RNA ölçümü için kullanılabilir. Bir numuneden floresans miktarı da konsantrasyonla orantılıdır ve konsantrasyonu bilinen benzer numunelerden standart bir eğri kullanılarak ölçülebilir.
Kaynak: denovix.com/blog/the-best-techniques-for-rna-quantification/