UV-Vis spektrofotometri yoluyla numunelerin mikrolitre hacimlerini ölçme yeteneği, son on yılda moleküler biyoloji laboratuvarlarında bir devrim olmuştur. Mikro hacim spektrofotometreleri kullanırken numunelerinizi hazırlamak ve ölçmek için en iyi uygulamayı anlamak, sonuçların doğruluğunu olumsuz yönde etkileyen ve bir numunenin sonraki analizini etkileyen hata kaynaklarından kaçınacaktır.
1. Numune Hazırlamanın Önemi
Numune izolasyon protokollerinin optimize edildiğinden ve numunelerin ölçümden önce saflaştırıldığından emin olun. Bir UV-Vis spesifikasyonunun, ilgilenilen numune ile aynı dalga boyunda emen kirleticiler arasında ayrım yapmadığını unutmayın. Tüm nükleik asitler, 260 nm’de veya civarında bir tepe noktası sergiler. Çift sarmallı bir DNA numune çözeltisindeki bozulmuş veya tek sarmallı DNA, 260 nm’de toplam absorbansa katkıda bulunarak bildirilen konsantrasyonun fazla tahmin edilmesine yol açacaktır.
Ölçülen absorbans oranlarının izlenmesi, numunenin saflığı hakkında bilgi sağlar ve numune hazırlamadaki olası sorunları belirler. Saf DNA ve RNA preparasyonları sırasıyla 1.8 ve 2.0 A260/A280 oranlarına ve 2 ile 2.2 arasında bir A260/230 oranına sahiptir. Bunlardan sapma, önceki oran için proteinin veya sonraki oran için karbonhidrat, guanidin, fenol veya glikojenin taşındığını gösterebilir.
Kör olarak uygun olmayan bir solüsyon kullanıldığında veya numuneler çok seyreltikse ve alt tespit limitine yakınsa saflık oranları da etkilenebilir.
2. Örnek Yüzey Temizliği
Boşlukları veya numuneleri yüklemeden önce hem üst hem de alt ölçüm yüzeylerinin temiz olmasını sağlamak, sonraki okumalarda sorunlardan kaçınmak için çok önemlidir.
Kirli bir örnekleme yüzeyinde (üstte veya altta) kör ölçüm yapılması, negatif spektrumlar (Şekil 1) veya gerçek değerlerden daha düşük olarak ölçülen örnek konsantrasyonları gibi hatalı absorbans değerlerine neden olur.
Belirli bir süre boyunca, bazı numunelerin tamponlarındaki deterjanlar veya alkoller ölçüm yüzeyinin koşulsuz hale gelmesine yol açarak numunenin kaide üzerinde boncuk şeklinde değil düz durmasına neden olabilir.
Açıklanan sorunlardan herhangi biri gözlenirse, numuneleri yeniden körlemeden ve ölçmeye devam etmeden önce üreticinin tavsiye ettiği temizleme protokolünü takip etmek önemlidir.
3. Boş Ölçümler ve Tamponlar
Doğru konsantrasyon ölçümleri için uygun bir Kör ön koşuldur. Kör okuma için numunenin içinde asılı olduğu aynı tamponu kullanın ve yüklemeden önce ölçüm yüzeylerinin temiz olduğundan emin olun. Numuneleri çalıştırırken negatif spektrumlar görmek, numune kaidelerinin kirli olduğunun veya bir numunenin yanlışlıkla kör olarak ölçüldüğünün güçlü bir göstergesidir.
Tamponları seçerken, ilgilenilen dalga boyunda güçlü bir şekilde absorbe eden bileşenler içerenlerden kaçının. Örneğin, 280 nm’de yüksek bir absorbansa sahip olan RIPA tamponlarında süspanse edilmiş proteinler. Bu tamponlar gerektiğinde, kolorimetrik analizler önerilir. Tamponların absorbans profili, su ile körleme ve tamponu bir numune olarak çalıştırarak kontrol edilebilir.
4. Örnekleri spektrofotometrenin algılama sınırları içinde ölçün
Tüm spektrofotometreler, çevre ve elektronik bileşenlerden kaynaklanan algılanabilir bir arka plan gürültüsüne sahiptir. Bir cihazın Alt Tespit Limiti, arka plan gürültüsünden ayırt edilebilecek en düşük analit miktarı olarak tanımlanabilir.
Tolerans özelliği, yüzde değeri veya belirli bir analit için konsantrasyon olarak verilebilir. Örneğin, dsDNA için tolerans özelliğinin 2 ng/µL olduğu durumlarda, 4 ng/µL’lik bir konsantrasyona sahip bir numune, elektrik gürültüsünün katkısı nedeniyle 2 ila 6 ng/µL arasında değişebilir.
5. Rutin en iyi uygulamalar
- Ölçümden önce vorteksleyerek numune solüsyonlarının homojen olduğundan emin olun.
- Numuneleri pipetlerken kabarcıkların oluşmasından kaçının.
- Tam 1 µL alikotun ölçüm yüzeyine iletildiğinden emin olmak için kalibre edilmiş pipetler ve uygun şekilde oturan uçlar kullanın.
- Parçanın ölçüm yüzeyine iletildiğini görsel olarak onaylayın. Protein numuneleri ucun dışına doğru sızabilir ve uygun şekilde dağıtılamayabilir.
- Her örnek için yeni bir uç kullanın ve tüm kopyalar için her zaman yeni bir alikot kullanın.
- Her ölçümden hemen sonra numuneyi hem üst hem de alt yüzeyden çıkarmak için kuru bir laboratuvar bezi kullanın.