Western Blot (WB) Analizi; Moleküler Biyoloji de protein solüsyonlarında aranan bir proteinin varlığını belirlemek, varsa bulunan proteinin miktarının ne kadar olduğunun test edildiği bir analiz yöntemidir.
WESTERN BLOT YÖNTEMİ NERELERDE KULLANILIR?
- Mikrobiyoloji
- İmmünoloji
- Kanser Biyolojisi
- Patoloji
- Protein Biyokimyası
- Doku çalışmaları
- Antikor testleri
WESTERN BLOT ANALİZİ;
- Hücre Lizatı; Hücrelerden işaretlenmek istenilen protein için uygun lizis çözeltisi ile protein lizatı elde edilir.
- Jel Elektroforezi; SDS-PAGE yöntemi ile proteinler ayrılır.
- Proteinin Jelden Membrana Transferi; Proteinler jelden membran üzerine transfer edilir.
- İmmün Blotlama ( Antikor inkübasyonu); Bloklama, primer antikor, sekonder antikor ilaveleri ve yıkama ile immün blotlama yapılır.
- Proteinin belirlenmesi ve Analiz Edilmesi; İstenilen proteinin görüntülenmesi ve miktarının belirlenmesi.
PROTEİNLERİN TRANSFERİ ve BOYAMA
- Transfer
- Membrandaki proteinlerin görünür hale getirilmesi
- Memran blokajı
- Birincil antikor ile inkübasyon
- İkincil antikor ile inkübasyon
- Geliştirme yöntemleri (boyama)
- Proteinlerin Jelden Membrana Transferi;
- Nitroselüloz membran metanol’de ( Metanol ve distile su) sallandıktan sonra ‘’Transfer Buffer’a’’
- Proteinler Hidrofobik etkileşim ve Elektrik yük etkileşimi ile jelden membrana transfer olur.
TRANSFER DÜZENEĞİ;
- Islak (wet) veya yarı kuru (semi-dry) transfer düzenekleri bulunmaktadır.
- Kullanılan transfer makinasına birkaç kat kurutma kağıdı konur ve iyice ıslanana kadar ‘’Transfer Buffer ‘’ dökülür, kabarcık çıkarmayacak şekilde üzerinden bastırılarak geçilir.
- Kuru kalmamasına dikkat edilerek membran, kurutma kağıdı üzerine konulur.
- Jel, membran üzerini gelecek şekilde yerleştirilir.
- Islaklık ortamın elektrik geçirgenliğini oluşturarak üstten alta ( eksiden artıya ) doğru, yani jelden mebmrana doğru protein transferi sağlanır.
- Üzerine kurutma kağıdı konularak, ‘’Transfer Buffer’’ Arada kabarcık oluşmamasına dikkat edilmelidir ve transfer makinası güç kaynağına bağlanır.
- Membran Blokajı;
- Blokaj, membran ile antikorlar arasındaki Nonspesifik bağlanmaları en aza indirmek için uyguylanmaktadır.
- Membran ile antikorlar arasındaki Nonspesifik etkileşim alanının blokajı, membranı bir dilue protein çözeltisi içinde ( BSA- Sığır serum albümini veya TBST- Yağsız süt tozu ) oda sıcaklığında 1 saat sallandırarak gerçekleştirilir.
- Yağsız süt tozu -TBST solüsyonundaki proteinler membran üzerinde, hedef proteinden yoksun olan tüm bölgeyi kaplar. Böylece kullanılacak olan primer antikorların yalnızca hedef proteinlere bağlanmaları sağlanır.
- Birincil Antikor ile İnkübasyon;
- Membran, birincil antikor çözeltisinde gece boyu +4 °C de inkübe edilir.
- Primer antikor çözeltisi yeniden kullanılmak üzere ayrılarak, membran yıkamaya alınır.
- Membrana eklenen birincil antikorun fazlası dökülür. Üzerine istenilen miktarda yıkama solüsyonu veya TBST eklenerek yıkama yapılır.
- İkincil Antikor İle İnkübasyon;
- Bu aşamada önemli olan, birincil ve ikincil antikorun aynı hayvana karşı antikor barındırmasıdır. Yani birincil antikor hangi hayvanın antijenine karşı yapıldıysa, ikincil antikorda aynı şekilde o hayvana ait olmalıdır.
- Kullanılacak ikincil antikor belli bir oranda sulandırıldıktan sonra membran üzerine dökülür ve 1 saat saklanarak bekletilmelidir.
- Membranı eklenen fazla antikordan arındırmak için membran üzerindeki ikincil antikor dökülür. Üzerine istenilen miktarda yıkama solüsyonu veya TBST eklenerek yıkama yapılır.
- Geliştirme Yöntemleri (Boyama);
- Biotin, fluoresan, rodamin, horseradish peroksidaz, alkalen fosfataz işaretleyicileri
kullanılabilir. - Kolorimetrik
- Chemiluminescent
- Radyoaktif
- Floresan
- Chemiluminescent substrat membran yüzeyine dokunmamaya dikkat ederek, steril bir pipet yardımı ile , tüm yüzeye uygulanır ve reaksiyon için 5 dakika beklenir. Kemiluminesans ajanı, ikincil antikor ile aynı konjüge grubu taşımalıdır ve ikincil antikora bağlanarak ışıma yapar.
Şevval ÇAKIR
Kaynaklar;
- thermofisher.com/tr/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/western-blot-transfer-methods.html#blotting
- Abcam-WESTERN BLOTTING – A BEGINNER’S GUIDE
- norbil.hacettepe.edu.tr/west_ornek.shtml