PCR sonrası DNA örnekleri için optimize edilmiş agaroz jel elektroforez deneyi.
Bu çalışma farklı laboratuvarlarda şartlara göre değişiklik gösterebilir. DNA örnekleri için optimize etmiş olduğumuz çalışmadan kısa kesitlerle teorisi anlatılmıştır.
1- 100 ml %2’lik (g/h) Agaroz jel için 2.0 g agaroz tartılır.
2- Tartılan agaroz 100 ml 1X Tris Asetat Edta ile çözülür.
3- Çözelti polimerleşmenin gerçekleşebilmesi için yaklaşık 5 dk. mikrodalgada kaynatılır. Bu aşamada çözeltinin buharlaşarak hacminin değişmesini önlemek amacı ile ağız kısmı mikrodalgadan etkilenmeyecek bir malzeme ile kapatılır. Biz bu basamakta pecete kullanıyoruz. Burada çözeltiyi kontamine etmemeye özen gösteriniz.
4- Mikrodalgadan alınan çözelti akar su altında dikkatli bir şekilde laboratuvar koşullarına soğutulur.
5- Soğutulan çözeltiye hızlı ve yürütme işleminin görünürlüğünü sağlamak amacı ile 3-4 mikrolitre Staining Dye (Biomatik Ezview Stain) eklenir.
6- Çözelti hızlı ve dikkatli bir şekilde karıştırılarak jel tankına dökülür ve jellşemenin gerçekleşebilmesi için 30 dk. beklenir. Bu aşamada jelin kontaminasyonunu önlemek amacıyla tankın üzeri uygun bir malzeme ile kapatılmalıdır.
7- Bu işlemin ardından jel, önceden 1X Tris Asetat Edta ile doldurulmuş elektroforez tankına dikkatli bir şekilde alınır. Elektroforez tankına jelin 4-5 mn üzerine kadar çıkacak miktarda çözelti eklenmesi yeterlidir.
8- Eletroforez tankına konulan jelde ki kuyucuklara 1. sırada standart olarak kullanılan ladder olmak üzere örnekler sırası ile yüklenir. burada örnekleri kuyucuklardan taşırmamaya özen gösteriniz.
8- Eletroforez kapağı kapatılır ve optimize edilmiş koşullar olan 100 voltta 30 dk jel yürütme işlemi başlatılır.
9- Yürütme işleminin ardından jel UV ışık altında görüntüleme sisteminde görüntülenir.
10- Bilgisayar yardımı ile jelin fotografı çekilir ve bu değerlendirilir.
