Agaroz Jel Elektroforezi (PCR sonrası DNA örneklerinde)
PCR sonrası DNA örnekleri için optimize edilmiş agaroz jel elektroforez deneyi.
Bu çalışma farklı laboratuvarlarda şartlara göre değişiklik gösterebilir. DNA örnekleri için optimize etmiş olduğumuz çalışmadan kısa kesitlerle teorisi anlatılmıştır.
1- 100 ml %2’lik (g/h) Agaroz jel için 2.0 g agaroz tartılır.
2- Tartılan agaroz 100 ml 1X Tris Asetat Edta ile çözülür.
3- Çözelti polimerleşmenin gerçekleşebilmesi için yaklaşık 5 dk. mikrodalgada kaynatılır. Bu aşamada çözeltinin buharlaşarak hacminin değişmesini önlemek amacı ile ağız kısmı mikrodalgadan etkilenmeyecek bir malzeme ile kapatılır. Biz bu basamakta pecete kullanıyoruz. Burada çözeltiyi kontamine etmemeye özen gösteriniz.
4- Mikrodalgadan alınan çözelti akar su altında dikkatli bir şekilde laboratuvar koşullarına soğutulur.
5- Soğutulan çözeltiye hızlı ve yürütme işleminin görünürlüğünü sağlamak amacı ile 3-4 mikrolitre Staining Dye (Biomatik Ezview Stain) eklenir.
6- Çözelti hızlı ve dikkatli bir şekilde karıştırılarak jel tankına dökülür ve jellşemenin gerçekleşebilmesi için 30 dk. beklenir. Bu aşamada jelin kontaminasyonunu önlemek amacıyla tankın üzeri uygun bir malzeme ile kapatılmalıdır.
7- Bu işlemin ardından jel, önceden 1X Tris Asetat Edta ile doldurulmuş elektroforez tankına dikkatli bir şekilde alınır. Elektroforez tankına jelin 4-5 mn üzerine kadar çıkacak miktarda çözelti eklenmesi yeterlidir.
8- Eletroforez tankına konulan jelde ki kuyucuklara 1. sırada standart olarak kullanılan ladder olmak üzere örnekler sırası ile yüklenir. burada örnekleri kuyucuklardan taşırmamaya özen gösteriniz.
8- Eletroforez kapağı kapatılır ve optimize edilmiş koşullar olan 100 voltta 30 dk jel yürütme işlemi başlatılır.
9- Yürütme işleminin ardından jel UV ışık altında görüntüleme sisteminde görüntülenir.
10- Bilgisayar yardımı ile jelin fotografı çekilir ve bu değerlendirilir.
