1. Bant Genişliği /Optik Rezolüsyon (Bandwidth/Optical Resolution);
Optik rezolüsyon elde edilecek spektrum kalitesi için kritik öneme sahiptir. Optik rezolüsyon veya bant genişliği, fotodiyot dizisi detektörlerinin (PDA) önemli bir özelliğidir ve spektral rezolüsyon, duyarlılık ve doğrusallık gibi performansın çeşitli yönlerini etkiler. PDA dedektörlerdeki ideal durum çalışılan dalga boyu aralığında ışığın her bir dalga boyunun (1 nm) numuden geçmesi ve 1 diyota (solda ki şekil) çarpmasıdır. Yani her 1 nm’nin 1 diyoda çarpması istenir. Bu durum 1 nm’nin en iyi optik rezolüsyonunu verir. Eğer 1 nm’lik ışık 3 diyotun üzerine yayılırsa, 3 nm’lik optik rezolüsyon (sağdaki şekil) ile sonuçlanır, bu da her dalga boyunun daha az odaklanması sonucunda kötü bir spektral veri sağlayacaktır.
Optik rezolüsyon terimi, diyot veya dijital rezolüsyon gibi PDA detektörlerinin özelliklerinde kullanılan diğer terimlerle karıştırılmamalıdır. Bu sayılar, çalışılan dalga boyu aralığındaki (örneğin, 190 ila 800 nm de bulunan 610 dalga boylarına eşittir) dalga boyu sayısının, detektör dizisinde bulunan (örneğin 512 diyot) diyotların sayısına bölünerek, elde edilen 1.2 nm diyot çözünürlüğü için belirlenir. Her bir diyot 1.2 nm dalga boyuna denk gelmektedir. Photo Diode Array(PDA) dedektörler eş zamanlı olarak 3D ve 2D olmak üzere 2 tür veri toplayabilir. Kütüphane eşleştirme ve pik saflık analizinde en iyi sonuç için, 3d resolüsyonu 1,2 nm’ye ayarlanmalıdır.
Optik rezolüsyon, spektrumlarda gözlenen ayrıntı miktarını belirleyecektir. Aşağıdaki şekil benzen için, 3.6 nm’ye kıyasla 1.2 nm resolüsyonda görülebilen spektral yapıyı göstermektedir. Çok benzer bileşikler arasında ayrım yapmak için 1.2 nm rezolüsyon gereklidir. Güvenilir pik tanımlaması sağlayan en yüksek kalitede spektral bilgi için en iyi optik rezolüsyon gereklidir.
Değişen bant genişliğinin S/N (sinyal/gürültü) ve spektral rezolüsyona etkisi aşağıdaki tabloda ve görsellerde verilmiştir.
Pik saflık ölçümü veya bileşik tanımlama gibi kalitatif analiz yapılacaksa daha dar bant genişliği tipik olarak seçilir. Tersine, detektör hassasiyetini optimize etmek için daha geniş bant genişlikleri seçilir.
Bir analitin izleme dalga boyu bir pikin lambda maks’a karşılık geldiğinde artan bant genişliği, baseline gürültüsünü ve lineer dinamik aralığı azaltırken pik yüksekliğini azaltma eğilimindedir. Birçok analiz için 3.6 nm rezolüsyon etkili olarak uygulanabilir. Aşağıdaki kromatogramda antrasen için rezolüsyon değerinin pik yüksekliği üzerindeki etkisi karşılaştırmalı olarak verilmiştir.
2. Yarık Genişliği (Slit Width):
Dar bir yarık genişliği, kalitatif analizler için faydalı olacak kadar iyi detaylara sahip UV spektrumları veren spektral rezolüsyon sağlar. Örneğin, arttırılmış spektral rezolüsyon, bir kromatogram içindeki bilinmeyen pikleri tespit etmeye çalışırken, kütüphane ile eşleşen arama sonuçlarının güvenini arttıracaktır.
Geniş bir yarık genişliği, akış hücresinden daha fazla ışığın geçmesine izin vererek fotodiyot dizisine ulaşmasını sağlar, dolayısıyla sinyal yoğunluğu ve detektör hassasiyeti artar. Böylece baseline gürültüsü azaltılarak sinyal/gürültü (S/N) oranlarında bir artışa yol açacaktır.
Bununla birlikte, daha geniş bir yarık genişliği ile, spektrofotometrenin optik rezolüsyonu azalır. Her diyot üzerinde düşen ışığın dalga boyu, ışık daha dağınık hale geldikçe daha az belirgindir. Herhangi bir fotodiyot, yarık genişliği tarafından belirlenen bir dizi dalga boyu içinde ışık alır ve böylece spektral rezolüsyon azalır.
Değişen yarık genişliğinin baseline gürültüsü ve spektral rezolüsyon üzerine etkisi aşağıdaki tablo ve görsellerde verilmiştir.
Şekil’de görülebileceği gibi, daha geniş yarık genişlikleri niceliksel analiz için daha iyiyken, nitel analiz için daha dar yarık genişlikleri daha iyidir. Bununla birlikte ideal olarak 4 veya 8 nm’lik bir yarık genişliği genellikle önerilebilir.
3. Referans Dalga Boyu /Refrans Dalga Boyu Aralığı / Numune Dalga Boyu (Reference Wavelength /Sample and Reference Settings);
Referans dalga boyu, ışık yoğunluğundaki dalgalanmaların yanı sıra, gradyan elüsyonu sırasında arka planın absorbans / refraktif indeksindeki değişimleri (örneğin hareketli faz) telafi eder. Özellikle gradient çalışmalarda, gradient değişim sırasında artan organik çözücü oranındaki dalga boyu girişimi ve refraktif indeks değişiminden kayanaklı girişimleri azaltır. Gradient elüsyon sırasında refraktif indeks değişir ve dolayısıyla kırılma indisi değişir. Bu değişimi telafi etmek için referans dalga Boyu her zaman ayarlanmalıdır, aksi taktirde aşağı veya yukarı yönde sürüklenen baseline çizgileri meydana gelir.
PDA dedektörler UV ve görünür bölgede ışık yayarlar. Böylelikle 190 nm ila 950 nm aralığında ölçüm yapabilirler. Numunenizdeki analitler hakkında çok az şey biliyorsanız her iki lambayı da kullanarak bu aralığın tümünde tarama yapın. İki lamba ile çalışmak daha geniş dalga boyu aralığında iyi hassasiyet sağlar. Deuterium deşarj lambası, UV aralığı (190 ila 400 nm) için enerji sağlar ve tungsten lamba, kızıl ötesi yakın görünür ve kısa dalga için 400 ila 950 nm ışık yayar.
Referans dalga boyu örnek sinyaline ne kadar yakın olursa gürültü de o oranda azalacaktır. Herhangi bir referans ölçümü yapılmadığı durumlarda ışık yoğunluğunda bulunan tüm gürültü ve değişkenlik, sinyal içerisinde kaydedilir. Yani hassasiyet azalmış olur. Bu durumun aksine bir referans sinyali kullanıldığında, tüm ışık yoğunluğu ve arka plan (hareketli faz) değişkenliği ölçülmekte olan sinyalden çıkarılır. Böylelikle hassasiyet artacaktır. Referans dalga boyu örnek dalga boyuna ne kadar yakın olursa bu arka plan sapmalarının daha etkin bir şekilde ve daha iyi bir detektör hassasiyeti için karşılanması o kadar iyi olacaktır. Bununla birlikte, referans dalga boyu analit dalga boyuna çok yakın seçilmemeli. Referans dalga boyunun analit dalga boyuna çok yakın olması durumunda elde edilecek analit sinyali azalacaktır. Uygun bir referans dalga boyunun seçimi, kromatografik baseline değişkenliği ve sapmayı azaltabilir ve gürültü performansına daha iyi sinyal verir.
Referans spektrum seçilirken yapılması gereken ilk işlem ilgili tüm analitler için UV spektrumlarına bakmanızdır. Bu spektrumlardan öncelikle piklerin en yüksek tepe noktaları yani en yüksek absorbans yaptıkları dalga boyları seçilmelidir. Bu değer aynı zamanda numune dalga boyudur. Bu değerin %50’si bant genişliği olarak belirlenir. Ardından ilgili analitlerin hiç absorbans yapmadığı 1mAu’luk baseline yüksekliğine sahip noktadan 10 nm güvenlik payı eklenerek (1 mAu’luk nokta 290 nm ise 290 nm + 10 nm = 300 nm) 100 nm aralıkta (mümkünse) bir referans dalga boyu aralığı belirlenir. Referans dalga boyunun belirlenmesi işlemi için referans aralığın başlangıç noktası olan noktaya 50 nm (ideal değer) eklenir.
4. Örnekleme Oranı / Tepki Süresi (Sampling Rate / Response Time);
Pik genişliği, tepki süresi, veya örnekleme oranı ayarı optimize edilmelidir. Bu işlem için her üreticinin kendine has isimlendirdiği ve izlediği bir optimizasyon yöntemi vardır. Bu nedenle öncelikli olarak üreticinin kılavuzları dikkate alınmalıdır.
Tepki süresi etkinlik, rezolüsyon ve hassasiyeti etkilemektedir.Şekilde görülebileceği gibi, tepki süresi bir ayırmanın verimliliği, çözünürlüğü ve hassasiyeti üzerinde önemli bir etkiye sahiptir ve dikkatli bir şekilde optimize edilmesi gerekir.
Bir pikin şeklini tanımlayabilmek için pik boyunca yeterli sayıda örnekleme noktası alınmalıdır. Bu örnekleme noktası ideal olarak 20-30 noktadır. Pikler nadiren mükemmel simetrik olduğundan, daha fazla sayıda nokta, pikin gerçek şekli ve toplam alanının daha doğru entegrasyonunu sağlayacaktır. Bu, analizden analize tekrarlanabilirliği ve nicelleştirmeyi iyileştirecektir. Örnekleme noktası azaldıkça pik şekli kötüleşecektir ve pikler arasındaki tanımlama kabiliyeti de bu oranda düşecektir. Örnekleme noktası arttıkça baseline gürültüsü artmakla birlikte daha keskin ve düzgün pik şekilleri elde edilir ve ayrıca bu işlem çok fazla veri toplama ile sonuçlanır. Bu ise toplanan ve saklanması gerekli veri boyutunu arttıracaktır. Her uygulama için bu oranların optimum değerleri belirlenmelidir.
Örnekleme oranını belirlerken örneğinize ait gerçek bir kromatogramdaki en dar piki referans almalısınız. Bunun temel nedeni en kötü durum senaryosunu düşünerek hesap yapmanızı sağlamaktır. Böylelikle kromatogramdaki daha geniş piklerde yeterli örnekleme oranının elde edildiğinden emin olabiliriz. Genişlik genellikle zaman birimi (saniye veya dakika) olarak ifade edilir.
Örneğin;
1- İdeal olarak belirttiğimiz 30 noktayı baz alalın ve en dar noktanız 1,00 dakikalık (60 saniye) pik genişliğine sahipse, veri noktası başına 2 saniyelik bir sonuç için 60 saniyeyi 30 noktaya bölün. Tercih edilen örnekleme oranı 2 saniye, 0,03 dakika veya 0,5 Hz olacaktır (dedektörünüz tarafından kullanılan ünitelere bağlı olarak).
2- En dar pikinizin pik genişliği 0,20 dakika (12 saniye) ise, veri noktası başına 0,4 saniye neticesinde 12 saniyeyi 30 noktaya bölün. Bu 1 noktayı 0.4 saniyede toplayacağı anlamına gelir. Veya 1 saniyede 2.5 örnekleme veya 2.5 Hz’lik bir örnekleme oranına eşittir.
Burada bahsedilen optimizasyon değerleri ayarlanırken öncelikli olarak üreticilerin size sunduğu kılavuzlardan faydalanmalısınız. Bu kılavuzlar üreticilerin spesifikasyonlarına uygun olarak size yol göstermektedir. Bununla beraber güvenilir analiz yöntemleri iyi uygulanmış optimizasyonlar sonucunda geliştirilebilir. İyi geliştirilmemiş analiz yöntemleri ürününüzün piyasadan geri çağrılmasına kadar varabilecek kötü sonuçlar doğurabilir. Bu nedenle kendinizi bu optimizasyonlar konusunda eğitmelisiniz ve her analize özgü bu değerleri optimize etmelisiniz.
Orhan ÇAKAN
Kaynaklar;
1-waters.com/webassets/cms/library/docs/wpp09.pdf
2-agilent.com/cs/library/slidepresentation/Public/2%20Diode%20Array%20Detector%20Optimization.pdf
3-crawfordscientific.com/technical/chromatography-technical-tips/hplc-chromatography-tips/diode-array-detector-settings
4-waters.info/webassets/cms/library/docs/wpp40.pdf
5-utsc.utoronto.ca/~traceslab/UV_Cutoff.pdf
6-agilent.com/cs/library/support/documents/faq183.pdf
7-waters.com/webassets/cms/support/docs/71500121902rc.pdf
8-chromacademy.com/chromatography-Diode-Array-Detector-Settings.html