Bir Yüzyıldan Fazlası: Nitrozaminler
“1874 yılında nitröz asitlerin (özellikle esterlerinin) ikincil ve üçüncül aminler üzerindeli etkisi üzerine yaptığım deneylerde, reaksiyon ürünleri olarak, çok güzel bileşikler oluştuğunu görmek beni oldukça şaşırttı, … , kullandığım “Nitrozamin” terimi, en az bir hidrojeni, tek değerlikli bir nitrozil grubu ile, -NO, yer değiştirmiş herhangi bir amonyak molekülü için geçerlidir.” (Otto N. Witt).
Her ne kadar Nitrozaminlerin kimyasal oluşma mekanizması, 1864’te Peter Griess tarafından (nitröz asidin birincil aromatik aminlerle kimyasal etkileşimi olarak gözlemlenmiş ve yayımlanmış olsa da N-Nitrozamin (ya da Nitrozamin) teriminin yaygın olarak kullanılması, konu üzerine daha geniş kapsamlı deneyler yürüten Baeyer, Caro ve Otto Witt’in çalışmaları aracılığıyla gerçekleşmiştir [2,3].
Yukarıda bahsedilen bilim insanlarının çalışmaları daha çok yeni boyar maddeler geliştirmek üzerine olmuş ve Nitrozaminler daha çok bu bağlamda değerlendirilmiştir. 1956 yılında ise Barnes and Magee,
N-Nitrozodimetilamin/Dimetilnitrozamin (NDMA/DMN) molekülünün karsinojenik etkisi üzerine yaptıkları çalışmada, beslenme yolu ile bu moleküle maruz kalan deney hayvanlarında (≥0.022 mg/kg/gün) yaşamı tehdit eden karaciğer tümörlerinin ortaya çıktığını ortaya koymuşlardır [4,5].
Nitrozaminlerin siyasi otoritelerin ilgisini ilk olarak çekmesine sebep olan olaylar zinciri, 1957-1970 yılları arasında, Norveç’te gerçekleşmiştir. İlk olarak, kürk çiftliği hayvanlarında (Mink), ikinci olarak da çiftlik hayvanlarında (büyük ve küçük baş), ağırlıklı olarak ağır karaciğer hasarı ve kanseri raporlanmıştır. Yapılan geniş kapsamlı çalışmalar, balıktan (Ringa/Tirsi) üretilen besin kaynağının (herring meal) koruyucu olarak yüksek miktarda nitrit ile muamele edildiğini ve 100 ppm (mg/kg) NDMA içerdiğini ortaya koymuştur [6,7].
Nitrozaminler ve Kanser
Nitrozaminlerin hayvanlar için karsinojenitesini kanıtlayan çok güçlü ve yeterli kanıtlar bulunmaktadır. İnsanlar için ise yine güçlü kanıtlar olsa da epidemiyolojik veriler yeterli olmadığı için, IARC tarafından çoğunlukla “Grup-2A ve 2B kanserojen madde” olarak tanımlanmaktadır. Bu bağlamda, Grup 1 (insan için karsinojen ajan) kanserojen olarak tanımlanan Nitrozaminler, tütün spesifik NNA: N-Nitrosonornicotine ve NNK: 4-(N-Nitrosomethylamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone’dur[3, 4, 7, 9, 15].
Farmasötik Ürünler ve Nitrozaminler
Giriş ve tarihçe başlığında kısaca özetlendiği şekilde, Nitrozaminler, nitrit veya nitröz oksitler ile nitrozlanabilen bileşiklerin reaksiyonu (örn. ikincil aminler) sonucu oluşan kimyasal bileşiklerdir. Bahsi geçen görece basit reaksiyon mekanizması, günlük hayatta sürekli olarak kullanılan; oyuncak, bebek bakım ürünleri (biberon, emzik vb) ve kişisel bakım ürünlerinin rutin olarak kontrolünü gerekli kılmıştır [9,10,11, 12].
Farmasötik ürünlerin Nitrozaminler ile kontaminasyonu ise, görece olarak, oldukça yeni bir konudur. 2018 yılında Avrupa İlaç Ajansı (EMA) ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA), Valsartan etken maddesi içeren ilaçlarda Nitrozamin kontaminasyonuna (NDMA) rastlandığını ilan etmiş ve bu etken maddeyi içeren ilaçların, kapsamlı olarak kontrol edilmesi amacıyla, piyasadan geri çağrılmasını üreticilere tavsiye etmiştir. Valsartan ile başlayan listeye, zaman içerisinde Losartan, Irbesartan gibi sartan grubu içeren ilaçların yanı sıra Pregabalin, Metformin, Rifampisin ve Ranitidin gibi sartan grubu içermeyen etken etken maddeleri içeriğinde barındıran ilaçlar da katılmıştır. Nitrozaminlerde de durum benzer şekilde NDMA ile kalmamış, rutin analizlerle kontrol edilen Nitrozaminlerin sayısı artmıştır. 2020 yılında EMA tarafından yayımlanan değerlendirme raporunda listelenen bazı Nitrozaminler, Tablo-1’de özetlenmiştir [13,14,15].
Farmasötik Ürünlerde Nitrozamin Analizi
Literatürde Nitrozaminlerin analizi için kullanılan GC-MS, GC-MS/MS, GC-HR/MS (sıvı-direkt enjeksiyon/LI, Headspace/HS, Katı Faz Mikro-ekstraksiyon/SPME), LC-MS/MS, LC-HR/MS (Orbitrap ve TOF /MS) gibi bir çok analiz tekniği bulunmakla birlikte, temel hedef farmasötik ürünlerdeki Nitrozamin kontaminasyonu ve/veya nitrozlanabilen bileşik kontaminasyonunu ölçmek olduğunda, her bir ürün ayrı bir başlık altında değerlendirilmeli ve hedef analitlerin kimyasal özellikleri, tayin edilmek istenen minimum limit değerler, sinyal interferansına sebep olabilecek diğer moleküllerin varlığı gibi önemli noktalar mutlaka göz önünde bulundurulmalıdır. Örneğin Gaz Kromatografi-Kütle Spektrometrisi (GC-MS) tekniği ile analiz gerçekleştiriliyorsa ve analitler içerisinde termal kararlılığı çok da iyi olmayan NDPh ve kaynama noktası görece düşük NDMA bulunuyorsa, standard sıvı-direkt enjeksiyon yerine, düşük sıcaklıklı HS enjeksiyon tekniğini tercih etmek daha doğru olacaktır[8,16,17]. Ayrıca örneklerde, limit üstü Nitrozamin veya nitrozlanabilen moleküllerin saptanması durumunda, ilgili ürünün kontaminasyon kaynağı mutlaka saptanmaya çalışılmalıdır. Çünkü tespit edilen kontaminasyon doğrudan etken madde kaynaklı olabileceği gibi üretimde kullanılan su, üretim ekipmanlarının temizlenmesi için kullanılan yüzey aktif maddeler, tekrar kullanım için geri kazanılmış çözgenler ve hatta ambalajlarda kullanılan baskı mürekkebi bile olabilir [7]. Yukarıda özetlenen analiz tekniklerinin karşılaştırılması, ve farklı kontaminasyon kaynaklarının irdelenmesi bu makalenin kapsamı dışındadır ancak bir sonraki başlık altında paylaşılan uygulamada da
Tablo 1: Üzerinde en çok çalışılan Nitrozaminler
| Nitrozaminin açık adı | Kısaltma | Cas# |
| N-nitrosodimethylamine | NDMA | 62-75-9 |
| N-nitrosodiethylamine | NDEA | 55-18-5 |
| N-nitrosomethylethylamine | NMEA | 10595-95-6 |
| N-nitrosodipropylamine | NDPA | 621-64-7 |
| N-nitrosodiisopropylamine | NDIPA / DIPNA | 601-77-4 |
| N-nitrosoethylisopropylamine | NEIPA / EIPNA | 16339-04-1 |
| N-nitrosodibutylamine | NDBA | 924-16-3 |
| N-nitrosomethylamino butyric acid | NMBA | 61445-55-4 |
| N-nitrosomethylphenylamine | NMPA / PMNA | 614-00-6 |
| N-nitrosomethyl-2-phenylethylamine | 13256-11-6 | |
| N-nitrosodiphenylamine | NDPh | 86-30-6 |
| N-nitrosodiethanolamine | NDELA | 1116-54-7 |
| N-nitrosopyrrolidine | NPYR | 930-55-2 |
| N-nitrosopiperidine | NPIP | 100-75-4 |
| N-nitrosomorpholine | NMOR | 59-89-2 |
| N-nitrosomethylnitroguanidine | NMNG / MNNG | 70-25-7 |
görüleceği üzere Nitrozamin analizlerinde bütüncül bir yaklaşım, hayati bir önem taşımaktadır.
LC-MS/MS (APCI) ve LC-HR/MS (HESI/Orbitrap) ile Farmasötik Ürünlerde Nitrozaminlerin Analizi [20]
(Bu çalışma, PBA-2023’de (33rd International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 02-06/07/2023, Ankara Üniversitesi, Ankara/Türkiye), PT068 Poster Numarası ile sunduğumuz çalışmanın bir özetidir.
Özet:
Bu çalışmada, tablet halindeki ilaçlarda NDMA ve NDEA’nın kantitatif analizi için bir APCI-LC-MS/MS yöntemi optimize edilmiş ve bu yöntem aynı zamanda NMBA, NDBA, NDIPA ve NEIPA’nın hedefli taranması için de uyarlanmıştır. Aynı zamanda örnekler LC-HR/MS yöntemi ile analiz edilmiş ve sonuçlar, elde edilen “Yüksek Çözünürlüklü MS” verileri ile doğrulanmıştır.
Materyaller ve metod:
Valsartan (X) ve Irbesartan (Y) içeren ilaçlar, yerel bir eczaneden alınmıştır.LC-HR/MS analizleri, Thermo Scientific marka, QExactive (HESI) model Orbitrap sistemi (Waltham, Massachusetts, ABD), LC-MS/MS analizleri ise, Shimadzu marka, LCMS-8040 (APCI, Kyoto, Japonya) model LC-MS/MS sistemi ile gerçekleştirilmiştir. Analizlerde, Sunshell-C18 (ChromaNik Technologies Inc., Osaka, Japan) kolonlar kullanılmış olup kolon boyutları; 100mmL.X3.0mm I.D. (APCI-LC-MS/MS) ve 100mmL.X2.1mm I.D., (HESI-LC-HR/MS), ve her iki kolon da 2.6µm partikül büyüklüğüne sahiptir.
(Analizde kullanılan standart ve çözgen ve mobil faz katkıları için yazara veya LabAkademi’ye ulaşabilirsiniz.)
Şekil 1: Basit (kaba) özütleme
Metod:
Numune hazırlığı için, basit (kaba) özütleme kullanılmış olup detaylar Şekil-1’de verilmiştir. LC-MS analiz metot detayları Tablo-2’de verilmiştir.
(detaylı bilgi için yazara veya LabAkademi’ye ulaşabilirsiniz)
Tablo 2: MS Analiz Koşulları
| LC-MS/MS | Orbitrap (LC-HR/MS) | |||
| MS Koşulları (İyon Kaynağı) | ||||
| İyon Kaynağı /Polarite | APCI/ (+) | İyon Kaynağı /Polarite | HESI/ (+) | |
| Sprey/Kurutma gazı Akış Hızı (L/dk) | 3/15 | Sheath/Aux Gas Flow Rate (Arb.) | 55/15 | |
| DL/HB Temp.(°C) | 250/400 | Capillary/Aux T. (°C) | 400/350 | |
| MS Koşulları (Kütle Analizörü) | ||||
| MS Modu | MRM | MS Modu | PRM/FullMS | |
| Döngü zamanı (msn) | 600 | Maks. IT (msn) | 100/70 | |
| Pause Time (msn) | 1 | Çözünürlük | 35000/70000 | |
| Dwell Time Min/ Max (msn) | 74/149 | AGC Target | 2e5/1e6 | |
Sonuçlar ve değerlendirme:
LC-MS/MS analizlerini temsil eden kromatogram “Resim 1: Numune X’in geri kazanım (5ng/mL) enjeksiyonuna ait kromatogram”da verilmiştir. Geri kazanım sonuçları “Tablo 3: Geri Kazanım ve S/N Oranları @5ng/mL”de özetlenmiştir. Sonuçlar, uygulanan LC-MS/MS metodu ile, NDMA ve NDEA’in 5ng/mL konsantrasyon seviyelerinde nicel analizinin mümkün olduğunu ortaya koymaktadır.
Bu seviyelerdeki S/N oranlarına göre her iki ilaçta da NDEA ve İrbesartan içeren ilaçlarda NDMA için daha düşük bir kantitasyon limitine ulaşmak da mümkün görünmektedir.
Tablo 3: Geri Kazanım ve S/N Oranları @5ng/mL
| Geri Kazanım (%) | Sinyal/Gürültü (S/N, @5ng/mL) | |||
| NDMA | NDEA | NDMA | NDEA | |
| Örnek X | 109 | 104,6 | 16.63 | 16.48 |
| Örnek Y | 82,6 | 98,8 | 30,45 | 40,04 |
Resim 1: Numune X’in geri kazanım (5ng/mL) enjeksiyonuna ait kromatogram (Multi-Segmented MRM)
Analizin NDMA kısmındaki ana sorun, özellikle Numune X’de yüksek bir zemin sinyali (BG) ve soru işareti ile belirtilen tanımlanamayan pik (bkz. «Resim 1: Numune X’in geri kazanım (5ng/mL) enjeksiyonuna ait kromatogram (Multi-Segmented MRM) ») olarak özetlenebilir. Bunun sebebi ise, NDMA’nın yüksek polaritesi sebebi ile ters faz kolonda az alıkonması ve yayvan bir pik şekline sahip olması ve kolondan eş zamanlı elue olan ve sinyali baskılayan (ion suppression) bileşikler veya izobarik bileşikler olabilir. Bu bileşikler üretim aşamasında kullanılan çözgen kaynaklı, reaksiyon ara ürünü vb. bileşikler olabilir ve üretim sonrası, verimli bir şekilde saflaştırılamadığı için veya bozunma safsızlığı olarak da çıkabilir[18,19].
Örneğin, Dimetilformamid’e (DMF) ait 15N izotop iyonu (C3H815N O), m/z=75.05708 değerine sahiptir, NDMA (C2H614N2O) ana iyonu ise m/z=75.05529 değerine sahiptir, bu iki molekülün molekül ağırlıkları arasında çok az bir fark (yaklaşık 1Da) bulunmaktadır ve çok yakın alıkonma zamanlarına sahiplerdir. LC-MS/MS kromatogramında, soru işareti ile belirtilen pik, LC-HR/MS kromatogramında gözlenmemektedir, bunun temel sebebi ise, DMF ve NDMA’e ait spektral piklerin yüksek çözünürlükte birbirinde ayrılmış olmasıdır (R: Resolution/Çözünürlük). Her iki monoizotopik pike ait Δm/z değerleri, Tablo-4’de özetlenmiştir.
Resim 2: Numune X (geri kazanım @5ng/mL) LC-HR/MS (Orbitrap) yüksek çözünürlüklü spektrum (B) ve XIC kromatogramı (A)
Tablo 4: DMF ve NDMA spektral pik performans değerleri
| Teorik m/z (Da) | Apeks m/z (Da) | m/z (ppm) | |
| DMF | 75.05708 | 75.05712 | 0.53 |
| NDMA | 75.05529 | 75.05522 | -0.93 |
Kullanılan Kısaltmalar:
| IARC | International Agency for Research on Cancer |
| GC-MS | Gas Chromatography Mass Spectrometry |
| GC-MS/MS | Gas Chromatography Triple Quadrupole Mass Spectrometry |
| LC-MS/MS | Liquid Chromatography Triple Quadrupole Mass Spectrometry |
| LC-HR/MS | Liquid Chromatography High Resolution Mass Spectrometry |
| TOF/MS | Time of Flight Mass Spectrometer |
| APCI | Atmospheric Pressure Chemical Ionization |
| HESI | Heated Electrospray Ionization |
| MRM | Multiple Reaction Monitoring |
| PRM | Parallel Reaction Monitoring |
| IT | Injection Time |
| AGC | Automatic Gain Control |
Kaynakça:
| [1] | Otto N. Witt, PhD., Journal of the Chemical Sciety, Transactions, Volume 33, 1878 | [11] | European Standard, EN 71-12, Safety of Toys-Part 12: N-Nitrosamines and N-nitrosable Substances, 2016 |
| [2] | Griess&Hoffmann, XVIII. On a new series of bodies in which nitrogen is substituted for hydrogen, RCS, 1864 | [12] | European Standard, EN 12868, Child use and care articles-Method for determining the release of N-Nitrosamines and N-nitrosable Substances from elastomer or rubber teats and soothers, 2017 |
| [3] | Halden et al. ,https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2018.07.098 | [13] | EMA, EMA reviewing medicines containing valsartan from Zhejiang Huahai following detection of an impurity, 2018 |
| [4] | US-ATSDR, Toxicological Profile for N-Nitrosodimethylamine (NDMA), April 2023 | [14] | Lei & Zhongli Zhang et al. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2022.114867 |
| [5] | P.N. Magee&J.M. Barnes, The Production of Malignant Primary Hepatic Tumours in the Rat By Feeding Dimethylnitrosamine, BRC, 1956 | [15] | EMA Assessment report, Nitrosamine impurities in human medicinal products, 2020 |
| [6] | H. Robles, http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-386454-3.00523-6 | [16] | Joerg Schlingemann et al. https://doi.org/10.1016/j.ejps.2021.106026 |
| [7] | Amol B. Khade & Swapnil J. Dengale et al. https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2023.105355 | [17] | Qing Lv et al. https://doi.org/10.1016/j.microc.2020.105878 |
| [8] | Maria Kristina Parr & Jan F. Josepha https://doi.org/10.1016/j.jpba.2018.11.010 | [18] | Sabina Paglialungaa & Aernout van Haarstb, https://doi.org/10.1016/j.xphs.2023.01.017 |
| [9] | Lingjun Ma et al. https://doi.org/10.1016/j.jafr.2023.100645 | [19] | Jingyue (Jan) Yang et al., LC-HRMS Based Analytical Platform to Determine Nitrosamines in Pharmaceuticals: Modern Analytical Techniques To Meet Regulatory Needs, FDA Science Forum, Session 4, 2021 |
| [10] | EU Council Directive, 76/768/EEC on the approximation of the laws of the Member States relating to cosmetic products, 1976 | [20] | Engin Bayram et al., PT068, Simultaneous Analysis of Nitrosamines in Pharmaceutical Products by Liquid Chromatography APCI-Triple Quadrupole Mass Spectrometry, PBA 2023 |
