Bottom-up Proteomiks

Moleküler kütle ve amino asit dizisinin tayini, protein tanımlamasında ilk adımdır. Proteinler tanımlandıktan sonra karakterize edilir. Kütle spektrometresi kullanılarak uygulanan temel iki yöntem vardır. Bu yöntemler Bottom-up ve  Top-down yaklaşımlarıdır ve Kütle Spektrometresi (MS) tabanlı protein karakterizasyonu için tamamlayıcıdır. Bozulmamış proteinler incelenmek istendiğinde top-down proteomiks yaklaşımı kullanılırken, sindirilmiş proteinler ile peptid analizi yapılmak istendiğinde ise bottom-up proteomiks yaklaşımı kullanılır. Her iki yaklaşımın da güçlü ve zayıf yönleri vardır.  Bottom-up stratejilerinde, peptid seviyesindeki proteomik ölçümler, kapsamlı protein tanımlaması için bir temel sunar. Bununla birlikte, tüm proteinin yalnızca bir kısmı genel olarak tespit edildiğinden, önemli bilgiler elde edilemeyebilir. Çünkü; farklı proteinlerden bir birinden ayırt edilemeyecek triptik peptidler elde edilebilir. Bu nedenle protein profili belirlemeye yönelik peptid merkezli bu yaklaşımda bazı veriler kaybolabilmektedir. Benzer şekilde, translasyon sonrası modifikasyonların (PTM’ler) eşgüdümü ile ilgili bilgiler genellikle eksiktir.

Sıvı kromatografiye bağlı tandem kütle spektrometresi,  iyonizasyon yöntemlerinin uygulanmasından sonra protein ve peptid analizinde önemli bir analitik yöntem haline geldi. Bottom-up yaklaşımında sindirilmiş proteinler on-line tandem kütle spektrometresi (MS/MS) kullanılarak MS analizine tabi tutulur. Aynı bottom-up yaklaşımı ile, özellikle MALDI-MS analizinde protein tanımlama için peptid kütle parmak izi oluşturma da kullanılır.

Shotgun proteomiği olarak bilinen bottom-up proteomik bir varyasyonda, büyük bir protein karışımı sindirilir ve oluşan peptidler bir boyutlu veya çok boyutlu kromatografiyle fraksiyonlanır ve daha sonra MS / MS ile analiz edilir.

 

 

 

Bottom up proteomik deneyleri için numune hazırlama işlemi, proteinden peptit seviyesine ulaşmak için birkaç işlem basamağı gerektirir ve çok zahmetli olabilir. Bu yaklaşımda en fazla zaman harcanan kısım proteinlerin homojenizasyon sonrası sindirim aşamalarıdır. Bu nedenle sindirim sürecinin hızlandırılması ile iş hacminde önemli bir kazanç elde edilebilir. Ayrıca bottom-up proteomik yaklaşımında bu basamak oldukça kritik öneme sahiptir.

Analizlerde uygulanacak proteomiks yaklaşımlar analizi gerçekleştirmek istediğimiz seviyeye göre seçilir. Tespit etmek istediğimiz protein büyüklüğü, çalışmak istediğimiz fonksiyonel gruplar vb. gibi yöntemler uygulanacak proteomik analiz stratejimizi belirler.

 

Kütle spektrometresi (MS) teknolojisinde ki gelişmeler bize proteinlerin bozulmadan (topdown) analizlerini de mümkün kılmaktadır.

Bottom-up proteomiks çalışmalarında proteinlerin sindirilmesi önemli ve dikkat edilmesi gereken bir basamaktır. Protein sindirimine yönelik yıllar içerisinde verim ve tekrarlanabilirliği artırmak amacı ile bir çok teknik geliştirildi.

Proteinlerin sindirilmesine yönelik klasik yaklaşımlar; proteolitik enzimlerin yer aldığı enzimatik sindirimler, kimyasallar kullanılarak gerçekleştirilen enzimatik olmayan sindirimlerdir. Bunlar çoğunlukla çözelti içerisinde veya bir jel içerisinde gerçekleştirilirler.

Farklı enzimlerin düzenli olarak eklendiği enzimatik sindirim için, çeşitli yarılma spesifiteleri ve verimlilikleri olan geniş bir proteolitik enzim aralığı mevcuttur. İlerleyen yazılarda Bottom-up proteomik yaklaşımlarında enzimatik sindirimden bahsedilecektir.

 

 

 

Kaynaklar;

1- Wu S, Lourette NM, Tolic N, Zhao R, Robinson EW, Tolmachev AV, Smith RD, Pasa-Tolic L (2009) An integrated top-down and bottom-up strategy for broadly characterizing protein isoforms and modifi cations. J Proteome Res 8:1347–1357

2-Advancements of Mass Spectrometry in Biomedical Research

3-Advances in drug-protein adduct analysis using LC–MS based proteomics (Linda Switzar)