DNA ve RNA İzolasyonlarında Kritik Noktalar ve Nanodrop Aplikasyonu
DNA ve RNA izolasyonları, moleküler biyoloji ve genetik araştırmalarında temel tekniklerden biridir. Bu nükleik asitlerin izolasyonu hassas ve dikkatli bir uygulama gerektirmektedir. İzolasyonları sırasında göz önünde bulundurulması gereken kritik noktalar bulunmaktadır. İzolasyon sonunda ise Nanodrop cihazında doğru bir aplikasyon uygulanması önemlidir.
- Örnek Hazırlığı
Nükleik asit izolasyonu için kullanılacak örnekler mutlaka uygun koşullarda saklanmalıdır. Mümkün olan en kısa sürede izolasyon işlemine geçilmelidir.
Kontaminasyonu önlemek için her zaman temiz laboratuvar ekipmanları ve kimyasalları kullanılmalıdır.
- Hücre Lizisi
Lizis tamponunu seçerken örnek tipinize uygun olanı seçtiğinizden emin olun. Örneğin, zenginleştirilmiş tamponlar protein ve yağları daha iyi çözebilir.
- DNase ve RNase Kontrolü
DNA ve RNA izolasyonu sırasında, DNase ve RNase enzimlerinin aktivitesini inhibe edecek yöntemler kullanılmalıdır. Aksi halde bu enzimler ilgili nükleik asititinizi parçalayacaktır.
- Safha Ayrımı
Fenol ve kloroform kullanarak yapılan ekstraksiyonlarda, emülsiyon oluşumunu minimize edin. Emülsiyon, safhaların ayrılmasını zorlaştırır ve örneğin kaybına neden olabilir.
Santrifüjleme işlemi sonrasında gözlenene faz ayrımına dikkat edin. Üst fazda kalan kısmı dikkatlice alın.
- Alkol Çökeltmesi ve Yıkama
DNA ve RNA’yı çökeltmek için izopropanol veya etanol kullanın. Alkolün miktarı ve soğukluğu çökelme verimliliğine etki edecektir. Yıkama aşamasında yeteri kadar alkol kullanılarak kontaminatlar uzaklaştırılmalıdır.
- Kalite Kontrolü
İzole edilen DNA ve RNA’nın saflığını analiz etmek için Nanodrop kullanın. Nanodrop kullanırken örnek yüzeyinin temiz olduğuna ve doğru blank kullandığınıza emin olun. En az 1 µL örneği Nanodrop’un örnek okuma yüzeyine baloncuk oluşmayacak şekilde koyun. 260/280 ve 260/230 oranlarına dikkat edin. 260/280 oranında 1.8 değeri genel olarak DNA için, 2.0 değeri genel olarak RNA için saf kabul edilmektedir. 260/230 değerleri genellikle 2,0-2,2 aralığındadır. Bunun dışındaki değerler protein, fenol ve diğer organik bileşiklerin varlığını gösterir.
