En İyi DNA Ölçüm Yöntemini Seçme
Nükleik asit ölçümü, birçok biyokimyasal iş akışında hayati bir adımdır. Doğru RNA ve DNA ölçümü, deney tekrarlanabilirliğini artırır ve önemli miktarda zaman kazandırabilir. Nükleik asit numunelerinin kesin konsantrasyonunu bilmek, kaynak yönetimine de yardımcı olabilir, böylece maliyetlerden ve sınırlı miktarda bulunan yüksek değerli malzemelerden tasarruf sağlar. Ancak RNA veya DNA miktarını kesin olarak gerçekleştirmek karmaşık olabilir.
RNA ve DNA ölçümü için çeşitli yöntemler mevcuttur ve bunların tümü eşit şekilde oluşturulmamıştır. Gerçek zamanlı PCR, DNA örneklerini ölçmek isteyen yaşam bilimciler için mevcut olan başka bir seçenektir. Ancak en iyi DNA ölçüm yöntemi hangisidir?
Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
Bazen qPCR olarak adlandırılan gerçek zamanlı PCR, duyarlılığı, özgüllüğü ve dinamik aralığı nedeniyle günümüzde kullanılan en yaygın RNA ve DNA niceleme yöntemlerinden biridir. Nükleik asit zincirlerinin parçalanmasına ve polimerleşmesine neden olan tekrarlanan termal döngü fazlarını içerir. Floresan raportörler parçaları boyar ve bir algılama aleti, döngü profilinin bir fonksiyonu olarak numunenin bağıl floresan birimlerini (RFU) ölçer. Sofistike olmasına rağmen, RNA ve DNA’nın gerçek zamanlı PCR nicelleştirmesinin dezavantajları vardır.
Çoğullama son derece zor olabilirken, sahip olma maliyeti genellikle engelleyicidir. Ek olarak, gerçek zamanlı PCR, yüksek düzeyde operatör uzmanlığı ve test hazırlama ve yürütme için önemli miktarda zaman gerektirir.
UV-Vis Spektrofotometri
Bir UV-Vis spektrofotometrisi, ışığın soğurulmasını o ışığın içinden geçtiği malzemenin özellikleriyle ilişkilendiren Beer-Lambert yasasına göre çalışır. Konsantrasyon, belirli dalga boylarındaki ve bilinen yol uzunluklarındaki ışık kullanılarak sorgulanabilen belirli özelliklerden biridir – ışığın numune boyunca kat ettiği mesafe. UV-Vis spektrofotometri, RNA ve DNA ölçümünde bir güç merkezidir, ancak performans cihazlar arasında farklılık gösterir. Tam otomatik yol uzunluğu ayarına sahip olanlar ve ultraviyole ve görünür spektrumda (190 – 840 nm) geniş bir aralıkta sürekli spektruma sahip lambalar tipik olarak en iyi sonuçları ve en yüksek esnekliği sunar.
Floresan
Nükleik asit numuneleri floresan reaktiflerle test edilir. Bir florometre, numuneyi bir veya daha fazla ışık kaynağından gelen belirli uyarma dalga boylarıyla aydınlatır ve yayılan ışık yakalanır ve Bağıl Floresan Birimlerine (RFU’lar) dönüştürülür. Bilinmeyen numunelerin konsantrasyonunu, bilinen konsantrasyonların standart eğrisiyle karşılaştırarak ilişkilendirmek mümkündür. Bu yöntem, kontaminasyon varlığında tek bir analit için son derece spesifik kitlerin geliştirilmesini sağlayan floroforların içsel bağlanma özgüllüğüne dayanır.
