Florometrik Analiz Yoluyla DNA ve RNA Sayımı
Çift sarmallı DNA (dsDNA), tek sarmallı DNA (ssDNA) ve RNA nicelemesini kapsayan nükleik asit ölçümü, aşağı akış deneylerinden önce numune konsantrasyonu bilgisi gerektiren yaşam bilimi uygulamalarında temel bir süreçtir. Her iki nükleik asit türü de tipik olarak iki optik teknolojiden biri kullanılarak ölçülür: ultraviyole görünür (UV-Vis) spektroskopi veya floresans ölçümleri.
Nükleik asit konsantrasyonlarının doğru bir şekilde ölçülmesi, yeni nesil dizileme, transfeksiyon, PCR ve klonlama gibi sonraki uygulamalar için kritik öneme sahiptir. Bu tür uygulamalar sıklıkla optimum performans için bir hedef nükleik asit konsantrasyonu ve saflık aralığı gerektirir ve konsantrasyonların yanlış belirlenmesi daha yüksek değişkenliğe veya test başarısızlığına neden olabilir.
Florometrik Analizin Prensipleri
Florometrik analiz, absorbans tabanlı yöntemlerden yaklaşık 1000 kat daha yüksek hassasiyet sağlar. Absorbans ile karşılaştırıldığında ilgili analite oldukça spesifik olmaları da floresan deneylerinin bir özelliğidir.
Florometrik yöntemlerle DNA, RNA veya Protein miktarının belirlenmesi, ilgili numuneye analite özgü floroforların bağlanmasını gerektirir. Numune/florofor kompleksi, bir ışık kaynağından belirli bir uyarma dalga boyu ile aydınlatılır. Florofor, karakteristik bir spektrum üzerinde ışık yayar ve yayılan ışığın miktarı numunedeki analit miktarı ile orantılıdır. Işık yakalanır ve bağıl flüoresan birimleri (RFU’lar) olarak kaydedilir. Bilinmeyen numunelerin konsantrasyonu, bilinen konsantrasyon numunelerinin standart bir eğrisiyle korelasyon yoluyla anlaşılabilir.
