HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi), farmasötiklerden gıdaya, çevre analizlerinden biyolojik örneklere kadar çok çeşitli alanlarda kullanılan güçlü bir analiz yöntemidir. Ancak başarılı bir HPLC analizi için sistemin kendisi kadar numunenin doğru hazırlanması da hayati öneme sahiptir. Bu yazımızda, HPLC sistemine uygun numune türlerinden, numune hazırlama tekniklerinden ve dikkat edilmesi gereken püf noktalardan bahsedeceğiz.

HPLC’de Analizi Yapılan Numune Türleri Nelerdir?

HPLC ile analiz edilebilecek numuneler oldukça geniş bir yelpazeye yayılır. Bunlardan bazıları şunlardır:

• İlaç ve farmasötik ürünler (tablet, kapsül, şurup, enjektabl form)
• Gıda ve içecek ürünleri (meyve suyu, süt, baharat, katkı maddeleri)
• Biyolojik örnekler (kan, idrar, plazma)
• Çevre örnekleri (içme suyu, atık su, toprak ekstraktları)
• Kimyasal ve endüstriyel ürünler (boyalar, kozmetikler, polimerler)

HPLC İçin Kullanılan Numune Hazırlama Teknikleri

HPLC sisteminde doğru ve güvenilir sonuçlar elde etmek için kullanılan başlıca numune hazırlama teknikleri şunlardır:

Filtrasyon

Amaç: Numuneyi partikül içeriğinden arındırmak.
Yöntem: 0.22 µm veya 0.45 µm gözenek çapına sahip şırınga filtreleri kullanılarak gerçekleştirilir.
Not: Filtrasyon, kolonu tıkayabilecek parçacıkların uzaklaştırılması için kritik bir adımdır.

Santrifüjleme

Amaç: Numunedeki askıda katı maddelerin çökeltilmesini sağlamak.
Uygulama: 5-10 dakika, genellikle 4000-10000 rpm arasında döndürülerek üst sıvı faz alınır.

Sıvı-Sıvı Ekstraksiyon (LLE)

Amaç: Anali̇ti organik bir çözücüye ayırmak.
Uygulama: Su ve organik çözücü karıştırılır, sonra fazlar ayrılır.

Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE)

Amaç: Matristen analitin seçici şekilde ayrılması.
Uygulama: Kartuşlara yüklenen numune, yıkama ve elüsyon adımları ile saflaştırılır.

Protein Çöktürme

Özellikle biyolojik örneklerde kullanılır.
Asetonitril veya metanol gibi çözücülerle karıştırılarak proteinler çöktürülür ve santrifüjlenerek üst faz analiz edilir.

Dilüsyon (Seyreltme)

Yüksek konsantrasyonlu numunelerin seyreltme işlemi ile HPLC sistemine uygun hale getirilmesi.
Uyumlu çözücüler (mobil faz veya benzeri) kullanılarak yapılmalıdır.

Numune Hazırlama Teknikleri Nasıl Uygulanır?

Numune hazırlamada genel bir adım sıralaması şu şekilde olabilir:

1. Numunenin fiziksel formuna karar verin (katı, sıvı, biyolojik, vb.).
2. Gerekirse çözme veya seyreltme işlemini uygulayın.
3. Santrifüj veya filtrasyon ile parçacıkları uzaklaştırın.
4. Gerekliyse SPE veya LLE gibi ayırma tekniklerini uygulayın.
5. Son olarak, elde edilen numuneyi uygun HPLC flakonuna alın.

HPLC Sistemine Numune Hazırlarken Nelere Dikkat Edilmelidir?

• Temizlik ve kontaminasyon kontrolü: Numune kapları, filtreler ve çözücüler mutlaka temiz ve HPLC derecesinde olmalıdır.
• pH uyumluluğu: Mobil faz ile numunenin pH uyumluluğuna dikkat edilmelidir.
• Çözücü seçimi: Numune çözücüsü, mobil faz ile uyumlu olmalı; sistemde kararsızlık veya pik bozulması yaratmamalıdır.
• Stabilite: Numune hazırlanıp hemen analiz edilmeyecekse, uygun koşullarda (buzdolabı, dondurucu) saklanmalıdır.
• Gözle kontrol: Numunede tortu, bulanıklık ya da renk değişimi olup olmadığı kontrol edilmelidir.
• İzlenebilirlik: Numune adı, hazırlama tarihi, çözücü ve konsantrasyon bilgileri etiketlenmelidir.

HPLC analizlerinin başarısı büyük ölçüde doğru ve özenli numune hazırlığına bağlıdır. Numune türüne göre uygun hazırlama tekniklerinin seçilmesi, analizde güvenilirlik ve tekrar edilebilirlik sağlar. Unutulmamalıdır ki; hatalı hazırlanmış bir numune, en gelişmiş HPLC sisteminde dahi hatalı sonuçlar doğurabilir.