Western Blot Analizi

Western Blot (WB) Analizi; Moleküler Biyoloji de protein solüsyonlarında aranan bir proteinin varlığını belirlemek, varsa bulunan proteinin miktarının ne kadar olduğunun test edildiği bir analiz yöntemidir.

WESTERN BLOT YÖNTEMİ NERELERDE KULLANILIR?

• Mikrobiyoloji
• İmmünoloji
• Kanser Biyolojisi
• Patoloji
• Protein Biyokimyası
• Doku çalışmaları
• Antikor testleri

WESTERN BLOT ANALİZİ;

• Hücre Lizatı; Hücrelerden işaretlenmek istenilen protein için uygun lizis çözeltisi ile protein lizatı elde edilir.
• Jel Elektroforezi; SDS-PAGE yöntemi ile proteinler ayrılır.
• Proteinin Jelden Membrana Transferi; Proteinler jelden membran üzerine transfer edilir.
• İmmün Blotlama ( Antikor inkübasyonu); Bloklama, primer antikor, sekonder antikor ilaveleri ve yıkama ile immün blotlama yapılır.
• Proteinin belirlenmesi ve Analiz Edilmesi; İstenilen proteinin görüntülenmesi ve miktarının belirlenmesi.

PROTEİNLERİN TRANSFERİ ve BOYAMA

• Transfer
• Membrandaki proteinlerin görünür hale getirilmesi
• Memran blokajı
• Birincil antikor ile inkübasyon
• İkincil antikor ile inkübasyon
• Geliştirme yöntemleri (boyama)

1. Proteinlerin Jelden Membrana Transferi;

• Nitroselüloz membran metanol’de ( Metanol ve distile su) sallandıktan sonra ‘’Transfer Buffer’a’’
• Proteinler Hidrofobik etkileşim ve Elektrik yük etkileşimi ile jelden membrana transfer olur.

TRANSFER DÜZENEĞİ;

• Islak (wet) veya yarı kuru (semi-dry) transfer düzenekleri bulunmaktadır.
• Kullanılan transfer makinasına birkaç kat kurutma kağıdı konur ve iyice ıslanana kadar ‘’Transfer Buffer ‘’ dökülür, kabarcık çıkarmayacak şekilde üzerinden bastırılarak geçilir.
• Kuru kalmamasına dikkat edilerek membran, kurutma kağıdı üzerine konulur.
• Jel, membran üzerini gelecek şekilde yerleştirilir.
• Islaklık ortamın elektrik geçirgenliğini oluşturarak üstten alta ( eksiden artıya ) doğru, yani jelden mebmrana doğru protein transferi sağlanır.
• Üzerine kurutma kağıdı konularak, ‘’Transfer Buffer’’ Arada kabarcık oluşmamasına dikkat edilmelidir ve transfer makinası güç kaynağına bağlanır.

2. Membran Blokajı;

• Blokaj, membran ile antikorlar arasındaki Nonspesifik bağlanmaları en aza indirmek için uyguylanmaktadır.
• Membran ile antikorlar arasındaki Nonspesifik etkileşim alanının blokajı, membranı bir dilue protein çözeltisi içinde ( BSA- Sığır serum albümini veya TBST- Yağsız süt tozu ) oda sıcaklığında 1 saat sallandırarak gerçekleştirilir.
• Yağsız süt tozu -TBST solüsyonundaki proteinler membran üzerinde, hedef proteinden yoksun olan tüm bölgeyi kaplar. Böylece kullanılacak olan primer antikorların yalnızca hedef proteinlere bağlanmaları sağlanır.

3. Birincil Antikor ile İnkübasyon;

• Membran, birincil antikor çözeltisinde gece boyu +4 °C de inkübe edilir.
• Primer antikor çözeltisi yeniden kullanılmak üzere ayrılarak, membran yıkamaya alınır.
• Membrana eklenen birincil antikorun fazlası dökülür. Üzerine istenilen miktarda yıkama solüsyonu veya TBST eklenerek yıkama yapılır.

4. İkincil Antikor İle İnkübasyon;

• Bu aşamada önemli olan, birincil ve ikincil antikorun aynı hayvana karşı antikor barındırmasıdır. Yani birincil antikor hangi hayvanın antijenine karşı yapıldıysa, ikincil antikorda aynı şekilde o hayvana ait olmalıdır.
• Kullanılacak ikincil antikor belli bir oranda sulandırıldıktan sonra membran üzerine dökülür ve 1 saat saklanarak bekletilmelidir.
• Membranı eklenen fazla antikordan arındırmak için membran üzerindeki ikincil antikor dökülür. Üzerine istenilen miktarda yıkama solüsyonu veya TBST eklenerek yıkama yapılır.

5. Geliştirme Yöntemleri (Boyama);

• Biotin, fluoresan, rodamin, horseradish peroksidaz, alkalen fosfataz işaretleyicileri
  kullanılabilir.
• Kolorimetrik
• Chemiluminescent
• Radyoaktif
• Floresan

• Chemiluminescent substrat membran yüzeyine dokunmamaya dikkat ederek, steril bir pipet yardımı ile , tüm yüzeye uygulanır ve reaksiyon için 5 dakika beklenir. Kemiluminesans ajanı, ikincil antikor ile aynı konjüge grubu taşımalıdır ve ikincil antikora bağlanarak ışıma yapar.

 

 

Şevval ÇAKIR

 

Kaynaklar;

1. thermofisher.com/tr/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/western-blot-transfer-methods.html#blotting
2. Abcam-WESTERN BLOTTING – A BEGINNER’S GUIDE
3. norbil.hacettepe.edu.tr/west_ornek.shtml