İlaç-Protein Adültülerinin Belirlenmesi ve Tanımlanmasında Yaklaşımlar

İlaç-protein adüktlerinin analizi, önemli güçlüklerle karşı karşıyadır. İlaç-protein adüklerinin saptanması ve tanımlanması için en önemli komplikasyon, aşırı derecede düşük miktardır. İlaçlar genellikle sadece tek bir reaktif metabolite biyolojik olarak aktive olmazlar,Fakat birkaç reaktif metabolit üretebilir, aynı zamanda bir veya daha fazla kararlı metabolite metabolize edilebilir. Ek olarak, oluşan reaktif metabolitler çoğunlukla GSH ile detokslanırlar ve proteinlere kovalent bağlama için yalnızca küçük bir bölüm bırakırlar. Büyük miktarlarda reaktif metabolitlerin üretildiği ve Glutathione (GSH)’nin tükendiği bir ilaç aşırı dozunda bile, hedef proteinin yalnızca bir dakikalık miktarı in vivo olarak modifiye edilir. Bu, yüksek APAP seviyelerine maruz kalan ve şiddetli karaciğer toksisitesinden muzdarip bir hastada düşük pmol / mL serum seviyeleri NAPQI-HSA’nın saptanması ile gösterilmiştir. Hedef proteinin yalnızca çok küçük bir yüzdesi modifiye edildiğinden, bu proteinin% 99’undan fazlası, halen modifiye edilmemiş halde bulunacak ve bu da ilaç-protein adüklerinin saptanmasında bir başka zorluk ortaya koyacaktır.

Modifiye edilmemiş proteinden modifiye edilmiş proteinin ayrılması son derece zordur. Çünkü; kovalent olarak proteine bağlanan küçük reaktif metabolit, makromolekülün moleküler karakteristikleri, yani kütle, yük ve boyut üzerinde genellikle önemsiz bir etkiye sahiptir. Sıvı kromatografi (LC) gibi geleneksel ayırma teknikleri, bu amaç için gerekli seçiciliği sağlamazlar. Kapiler elektroforez (CE) küçük modifikasyonların neden olduğu protein izoformlarını etkin bir şekilde ayırır.  CE-kütle spektrometresi (MS) arayüzünün yeni geliştirmeleri, ayrılmış izoformların ve protein modifikasyonlarının doğru algılanmasını ve tanımlanmasını sağlar.

İlaç-protein adüktlerinin saptanması ve tanımlanması için analitik yöntemler kabaca global ve targeted (hedflenmiş) yaklaşımlara olarak verilebilir. Global yaklaşımlar genellikle radyoaktif işaretlenmiş ilaçların iki boyutlu jel elektroforez (2D-GE) ve bottom-up proteomikler ile kombinasyon halinde kullanılması üzerine kuruludur ve reaktif ilaç metabolitlerinin protein hedeflerinin belirlenmesine başarıyla uygulanmıştır. Bu şekilde sıçan karaciğerinde tiyobenzamidin (TB) 42 sitozolik ve 24 mikrozomal protein hedefi belirlendi.

Tanımlanan proteinler geniş bir biyolojik fonksiyon yelpazesine hizmet eder, ancak sitotoksisite bağlamında birkaç grup ayırt edilebilir, diğer bir deyişle, aracılık enzimleri Metabolizma ve ısı şoku ve stres tepki proteinleri. Reaktif ilaç metabolitlerinin bu tür proteinlere kovalent olarak bağlanması, proteinlerin enzim inhibisyonunda veya yanlış katlanmasında rol oynayabilir ve bu da hücre canlılığı için ciddi sonuçlar doğurabilir veya apoptozise neden olabilir.

Benzer şekilde, 15 sıçan karaciğeri proteini muhtemelen 12 tanesi önceden belirlenmemiş hedef olan tienil asidinin hedefi olarak tanımlandı. Yine tanımlanan proteinlerin çoğunluğu metabolik ve katabolik hücresel süreçlere katılan enzimlerdir ve bunların modifikasyonu veya inhibisyonu tienil asit ADR’lerde yer alan mekanizmayı açıklamak için bağışıklık sistemi ile kombinasyon halinde kullanılabilen hücresel strese neden olabilir.

Tablo-1 : İlaç-protein adüktlerinin analizi için başlıca yaklaşımlar.

Protein hedeflerindeki ortaklıklar, farklı ilaç metabolitlerinin protein adüktlerinin benzer yolları etkileyerek aynı  Adverse Drug Reactions (ADR)’ye yol açabileceğini ima edebilir. Hedef proteinler ve ilaçlar arasındaki daha fazla ortaklık, belki de standartlaştırma yöntemleri daha hassas ve tekrarlanabilir hale geldiğinde keşfedilebilir.

Ne yazık ki, radyoaktif etiketli ilaçlar sadece in vitro deneylerde veya in vivo hayvan modellerinde kullanılabilir ve bu tür bir yaklaşım, hasta numunelerinde veya insanlardaki klinik araştırmalardaki örneklere uygulanamaz.  Ayrıca, global yaklaşımlar, adükt sitini içeren proteolitik peptidin saptanamamasından ötürü ilaç metabolitinin kimliğini veya adükt oluşumu alanını genellikle aydınlatmaz. İlaç-protein adüktlerinin bu tür ayrıntılı bir şekilde tanımlanması ve adükt oluşumunun kesin olarak onaylanması, targeted bir yaklaşımla sağlanabilecek daha yüksek bir seçicilik ve duyarlılık derecesi gerektirir. Targeted bir yaklaşımla elde edilen derinlemesine bilgi, reaktif ilaç metabolitlerinin proteinleri nasıl düzenlediğini, belirli amino asit kalıntılarının modifikasyonunun protein fonksiyonunu nasıl değiştirebildiğini ve downstream sinyalleme yollarını nasıl etkilediğini anlamada çok önemlidir.

Targeted bir adükt-proteomik yöntem, kompleks bir matristen (örneğin, doku veya serum) seçici olarak saflaştırılan tek bir protein hedefi üzerine odaklanır.  Potansiyel olarak ilginç protein hedeflerinin seçimi, radyoaktif işaretler gibi seçici etiketleme kullanılarak global yaklaşımlarla elde edilen bilgilere dayanarak gerçekleştirilir. Hedef proteinin, örneğin afinite kromatografisiyle seçici olarak saflaştırılması çoğunlukla kalitatif veya kantitatif proteomik yaklaşımların bir ön şartıdır ve düşük yoğunluklu proteinlerin yanı sıra protein etkileşimlerinin, örn. Protein-protein kompleksleri ve Post-Translasyonel Modifikasyonlar (PTM’ler) gibi modifikasyonlar ve glutatiyon konjugasyonu hakkında bilgi verir.  Tüm ekstraksiyon yöntemleri ile seçilen protein belirli bir seviyede saflaştırılır ve arka planda daima düşük miktarda protein bulunur, ancak diğer proteinlerden gelen örnek karmaşıklığı ve parazitler önemli ölçüde azaltılır.

Saflaştırılmış protein fraksiyonu, yani hem adükt edilmiş hem de modifiye edilmemiş türleri içeren numuneler, analizden elde edilen bilgi içeriğini en üst düzeye çıkarmak için, spesifik olarak seçilen koşullar kullanılarak muamele edilir. Sistein kalıntılarının sayısı ve protein sırası hakkında önceden bilgi sahibi olunması, proteinin indirgenmesi, alkilasyonu ve sindirimi gibi uygulama koşullarının  seçilmesini ve optimizasyonunu mümkün kılar.

Trypsin benzersiz özgünlüğü ve etkinliği nedeniyle enzimatik protein sindiriminde altın standart olarak düşünülür, ancak triptik bölünme alanlarının eksikliği veya fazla olması, başka bir enzimin veya muhtemelen çoklu enzim sindiriminin kullanılmasını gerektirebilir. Kullanılacak proteolitik enzimin, protein dizisi bilgisi ve muhtemel adükt oluşum sahalarının öngörülmesi ile birlikte değerlendirilmesi, ilaç-protein adüktlerinin daha iyi belirlenmesine ve tanımlanmasına yol açabilir.

Özetlemek gerekirse, ADR(adverse drug reactions)’lerin arkasındaki mekanizmalardaki ilâç protein adüktlerinin kesin rolünü ortaya çıkarmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyulmaktadır. Analizleri, özellikle biyolojik dokuların ve sıvıların düşük miktarda bulunan protein fraksiyonlarında, zorludur, ancak advers reaksiyonlarda rol alan etkilenmiş biyolojik yolların belirlenmesi için zorunludur. Özellikle ilaç-protein adükt tespiti, tanımlanması ve nicelenmesi için analitik metodolojilerin geliştirilmesi, ADR’lerin daha iyi anlaşılabilmesi için vazgeçilmezdir.

Kaynaklar;

1- Advances in drug-protein adduct analysis using LC–MS based proteomics, Linda Switzar Kitabından özet şeklinde çeviridir. syf 14-20