Kromatografinin Teorisi

Kromatografinin Teorisi

Kromatografi, 20. yüzyılın başlarında Rus botanikcisi Mikhail Tswett tarafından keşfedilmiştir. Mikhail Tswett içerisinde Klorofil ve ksantofiller gibi çeşitli pigmentleri içeren çözeltiyi, toz halinde kalsiyum karbonatla (CaCO3) doldurulmuş bir cam kolondan geçirerek birbirinden ayırmayı başarmıştır. Yaptığı işlemde maddelerin zamanla ayrılarak kolon içerisinde renkli bölmeler oluşturduğunu gözlemlemiştir. Ayırma yöntemine bu nedenle; renkli fotoğraf anlamına gelen kromatografi (chromatography ) olarak adlandırılmıştır. Yeni yöntemlerin geliştirilmesi ve kromatografi uygulamalarının çeşitlendirilmesi son 50 yılda bir hayli ilerlemiştir.

 

Kromatografi Tanımları;

En genel tanımlama ile kromatografi; karışımlarda bulunan maddeleri bir birinden ayırmaya olanak veren tekniktir. Kromatografik uygulamalarda bir “sabit faz” ve bir “hareketli faz” bulunur. Sabit ve hareketli faz örnekte bulunan  maddelerin göç etme hızlarını farklılaştırarak ayrım sağlar.

Kromatografinin IPAC tanımı; “Ayrılacak olan bileşenlerin bir tanesi sabit olarak dururken diğeri belli bir yöne doğru hareket eden (mobil durumdaki) iki faz arasında dağıldığı fiziksel bir ayırım tekniğidir. “ olarak yapılmıştır.

HPLC’de sabit faz genellikle ya küçük partiküler yapıda, gözenekli yüzey aktif bir katıdır ya da asıl katı destek (çoğunlukla silika) malzemenin mikro partikülat tanecikleri üzerine kaplanmış bir sıvıdır.

Kromatografiyi tanımlarken aşağıda ki resimde görülen nehir benzetmesini sıklıkla kullanırım. Şöyle ki; sabit hız ve debide akan bir nehir düşünün ve nehir boyunca zemin düz ve tüm zemin aynı boyut ve özellikteki kum taneleri ile kaplı olsun. Zemindeki  bu kum taneleri (Nehir Zemini) sabit fazımızı oluşturur. Sabit debide ve hızda akan su ise hareketli fazımızı oluşturur. Bu nehire bir yaprak ve bir taş atalım. Taş ağırlığından dolayı nehir zemini ile temas edecek ve akış yönüne zıt belirli bir sürtünme kuvvetine maruz kalacaktır. Yaprak ise su yüzeyinde ilerleyerek taşın maruz kaldığı sürtünme kuvveti olmadan ilerleyecektir. Burada ağırlıkları dikkate almayınız. Dikkat etmeniz gereken husus sabit faz( kum yüzey) ile etkileşen taş nehir içinde aynı yolu daha uzun sürede giderek hedef noktaya ulaşırken, yaprak mobil faz(akar su) ile daha fazla etkileşerek aynı yolu daha kısa sürede kat edecektir. Kromatografide tıpkı bu şekilde maddeleri sabit ve hareketli faza olan ilgilerine göre ayırmaktadır.

 

Dağılım Katsayısı (Kx);

Kromatografinin en temel unsuru dağılım katsayısıdır. Hem kimyasal hem de fiziksel olarak farklılık gösteren bileşiklerin kromatografik ayırma yöntemleri ile nasıl ayrılabildiklerini açıklar.

Dağılım Katsayısına ilişkin denklem aşağıda yer almaktadır. Bu denklem herhangi bir bileşik için “faz tercihi” olarak betimlenebilir.

Kx = Cstat / Cmob

Denklemde;

Cstat : X bileşiğinin sabit faz içindeki konsantrasyonu.

Cmob : X bileşiğinin mobil faz içindeki konsantrasyonu.

Belirli bir kromatografik koşullar bütününde her bir bileşik için farklı bir Kx değeri vardır. Kromatografik ayrımlar buradan yola çıkılarak sabit faz ve mobil fazın doğasını değiştirerek sağlanabilir. Bu farklılaşmalar sonucunda dağılım katsayısı değeri değişecektir ve ayrım sağlanmış olacaktır.

Kromatografik Süreç;

Aşağıdaki örnekte zamana karşı absorbans grafiği elde ettiğimiz bir UV-Vis dedektör çalışmasını ele alalım. Mobil fazın ok yönünde ve sabit akışta hareket ettiğini düşünelim.

Görselde görünen mavi analitlerin sabit faza olan afiniteleri daha fazla olduğu için kolonda tutunma süreleri daha uzundur. Kırmızı maddelerin ise mobil faza olan afiniteleri daha fazla olduğu için kolonda tutunma süreleri mavi maddelere göre daha kısadır. Böylelikle dedektöre ulaşacak ilk madde bu farklılıktan dolayı kırmızı maddeler olacaktır. Ardından mavi madde dedekte edilecektir. Sonuç olarak maddelerin sabit ve hareketli faza olan ilgilerinden yararlanılarak bir ayrım gerçekleştirilmiştir. Dedektöre ulaşan maddeler zamana karşı absorbans kromatogramı olarak okunur.

Kromatografide Kullanılan Ayrım Teknikler;

Kromatografik teknikler ayrılması istenilen bileşiklere göre farklı kimyasal ve mekanizmalara dayanmaktadır. Ancak tamamı bir analit molekülünün aşağıdaki özelliklerinden faydalanır;

• Polarite
• Dipol
• İndüklenmiş dipol
• İyonlaşma potansiyeli

Bu özellikler analitin mobil faz ve sabit faz ile olan etkileşim, çözünürlük gibi parametrelerini yönetmek için kullanılarak ayrımlar aşağıdaki tekniklerle sağlanır.

 

Kaynaklar;

1- www.bayar.edu.tr

2-Krom Akademi HPLC eğitim notları