Top-down Proteomiks
Kütle spektroskopi (MS) sistemleri kullanılarak yapılan protein karakterizasyonu işlemlerinde yaygın olarak uygulanan iki yaklaşım mevcuttur. Bozulmamış protein analizleri için top-down yaklaşımı kullanılırken, sindirilmiş protein analizlerinde bottom-up yaklaşım kullanılır.
Top-down yaklaşım protein izoformlarının veya proteinler içindeki potansiyel PTM’lerin (Post Translational Modifications) belirlenmesini sağlar. MS sistemlerindeki son gelişmeler proteinlerin doğrudan (bozulmadan) analiz edilebilmesine olanak sağlamaktadır. Top-down yaklaşımda MS sistemleri kullanılarak; collisional-activated dissociation (CAD), electron-capture dissociation (ECD), veya electron transfer dissociation (ETD) yöntemleri ile saflaştırılmış proteinlerin bozulmamış protein kütlesi ve amino asit dizisi hakkında bilgi edinilebilir.
Top-down protein analizleri numune hazırlığı için harcanan zaman ve sarfları minimuma indirir ve çoğu zaman diğer proteomik stratejilerde kaybedilebilen bilgileri muhafaza eder. Örneğin; PTM ‘lerin ve etkileşimlerinin kaybedilmesi gibi. Bu avantajı ile beraber nispeten duyarsız bir yaklaşımdır. Analitlerin büyüklüğü nedeni ile çözünürlük ve kütle doğruluğu açısından analiz edilecek MS sistemleri üst düzey yeteneğe sahip olmalıdır.
Pratikte, top-down proteomik kullanarak analiz edilebilen proteinlerin kütle aralığı ~ 50 kDa (~ 50000 Da) ile sınırlıdır, bu sayı yaklaşık 500 amino asite eşdeğerdir. Ayrıcas, sadece C- ve N-terminalleri dizilir.
Proteomik analizlerin büyük çoğunluğu MS analizi öncesinde proteinlerin peptidlere sindirilmesi yöntemine dayanmaktadır.
Top-down proteomik yaklaşım bozulmamış proteinlerin analizi yolu ile benzersiz proteoformları belirleyebilir ve nicel hale getirebilir. Proteinler tipik olarak bir Fourier transform iyon siklotron rezonansı (Penning trap) veya quadrupole ion trap (Paul trap) kütle spektrometresi elektrosprey iyonizasyonuyla ile iyonize edilir. Tandem kütle spektrometresinde parçalanma Electron Capture Dissociation (ECD) veya Electron Transfer Dissociation (ETD) teknikleri ile gerçekleştirilir.
Top-down yaklaşımı yüksek teknoloji ile donatılmış Kütle spektrometre cihazlarına ihtiyaç duyar. Günümüzde son teknolojik gelişmeler doğrultusunda bu sistemleri uygulayabilecek cihazlar teknolojileri geliştirilmeye devam edilmektedir. Özellikle top-down çalışmalarında tercih edilecek sistemlerin tüm detayları ile incelenmesi ve bilinmesi gerekmektedir. Bu yalaşımın ihtiyaç duyduğu hassasiyet, seçicilik, tekrarlanabilirlik gibi bir çok parametre değerlendirilmeli ve sistemler buna göre tercih edilmelidir. Ayrıca firmaların sunduğu aplikasyon desteği de tercihler konusunda ayrı bir başlık olarak değerlendirilmelidir.
Seçilecek yüksek performanslı cihazlar, proteoformların niceliksel bir analizini yapabilir, onları tanımlayabilir ve bunları tandem MS / MS ile derinden karakterize edebilir kabiliyette olmalı ve bunu ispatlamış olmalıdır.
