Gen Klonlamak İçin Vektör: Plazmitler

Lab Akademi 16 Temmuz 202016 Temmuz 2020 0 Comments rna

DNA molekülünün bir gen klonlama vektörü olarak kullanılabilmesi için birden fazla özellik göstermesi gerekmektedir. Bunlardan en önemlisi konak hücre içerisinden replike olmalıdır. Böylelikle rekombinant DNA molekülünün sayısız kopyalarını üretebilir ve aynı zamanda kardeş hücrelere geçebilir. Bir gen klonlama vektörünün, büyük moleküllerin saflaştırma aşamasında kırılmaya eğilimli olması ve manipüle edilmesi zor olduğundan dolayı 10 kb’ dan küçük olması en ideal olanıdır. Bu şartları sağlayan iki çeşit DNA molekülü bakteri hücrelerinde bulunabilir. Bunlar: plazmitler ve bakteriyofaj kromozomlarıdır. Plazmitler sıklıkla klonlama vektörleri olarak kullanılsa da, günümüzde kullanımda olan en önemli vektör tipleri bakteriyofajlardan üretilmektedir.

Plazmitler ve Temel Özellikleri

Plazmitler bakteri hücrelerinden bağımsızdırlar. Halkasal DNA moleküllerine sahiptirler (Şekil 1).

**Şekil 1.** Plazmitler: bakteri hücrelerinde bulunan bağımsız genetik elemanlar.

Bir ya da birden fazla gen taşımaktadırlar. Bu genler genellikle konak bakteri tarafından oluşturulan yararlı bir karakterden sorumludur. Örneğin, örnek olarak kloramfenikol ve amfisilin gibi antibiyotiklerin toksik konsantrasyonlarında yaşama yeteneği, antibiyotik direnç genleri taşıyan bir plazmitin bakterideki varlığından dolayıdır. Laboratuvarda, antibiyotik direnci bir kültürdeki bakterilerin belirli bir plazmit içerdiğini tespit etmek için seçici belirteç olarak kullanılır (Şekil 2).

**Şekil 2.** Bir plazmit için seçici bir belirteç olarak antibiyotiğe dirençliliğin kullanımı. RP4 (üst) amfisilin, tetrasiklin ve kanamisine dirençlilik genleri taşır. Yalnızca RP4 (ya da benzer plazmitler) içeren E. Coli hücreleri, bu antibiyotiklerin bir ya da daha fazlasını toksik miktarlarda içeren bir ortamda hayatta kalıp, büyüyebilirler.

Plazmitlerin çoğu replikasyon orjini olarak iş görebilen en az bir DNA dizisine sahiptirler. Replikasyon orjini sayesinde ana bakteri kromozomundan bağımsız olarak çoğalabilirler (Şekil 3). Küçük plazmitler kendi kopyalarını oluşturabilmek için hücrenin kendi DNA replikatif enzimlerini kullanırlar. Büyük olan plazmitler ise replikasyon için spesifik olan özel enzimler kodlayan genler taşımaktadırlar.

**Şekil 3.** (a) İntegratif olmayan plazmit ve (b) bir epizom için replikasyon stratejileri.

Bazı plazmit tipler, bakteri kromozomuna kendilerini sokarak replike olmaktadırlar (Şekil 4). Bu integratif plazmitler ya da epizomlar, çok sayıda hücrenin bölünmesiyle bu formlarında sabit kalabilirler. Fakat her hangi bir aşamada bağımsız olarak bulunurlar. Entegrasyon bazı bakteriyofaj kromozomlarının da önemli bir özelliğidir. Bu integratif plazmitler ya da epizomlar, çok sayıda hücrenin bölünmesiyle bu formlarında sabit kalabilirler. Fakat her hangi bir aşamada bağımsız olarak bulunurlar. Entegrasyon bazı bakteriyofaj kromozomlarının da önemli bir özelliğidir.

**Şekil 4.** Plazmit bakteri hücreleri arasında konjugasyonla aktarılır. Verici ve alıcı hücreler, verici hücrenin yüzeyinde bulunan içi boş bir uzantı olan bir pilus aracılığıyla birbirine bağlanır. Aktarmanın pilus aracılığıyla gerçekleştiği sanılmaktadır fakat bu henüz ispatlanmamıştır ve bazı diğer yollarla (yani, bakterilerin hücre duvarlarından doğru geçme) aktarım bir olasılık olarak kalmaktadır.

Büyüklük ve Kopya Sayısı

Klonlama söz konusu olduğunda, plazmitin büyüklüğü ve kopya sayısı büyük öneme sahiptir. Plazmitler 1.0 kb’ dan en büyüğü 250 kb’ a kadar olabilir (Tablo 1). Bu sebeple sadece birkaçı klonlama amacı için kullanışlıdır. Büyük plazmitler ise bazı özel şartlar altında klonlama için uyarlanabilirler.

Plazmit	Büyüklük		Organizma
	Nükleotit Uzunluğu (kb)	Moleküler Kütle (MDa)
pUC8	2.1	1.8	E. coli
ColE1	6.4	4.2	E. coli
RP4	54	36	Pseudomonas ve diğerleri
F	95	63	E. coli
TOL	117	78	Pseudomonas putida
pTiAch5	213	142	Agrobacterium tumefaciens

Tablo 1. Tipik plazmitlerin büyüklükleri.

Kopya sayısı, normal olarak tek bir bakteri hücresinde bulunan tek bir plazmitin molekül sayısını ifade eder. Kopya sayısını kontrol eden faktörler iyi anlaşılmamıştır, ancak her bir plazmit, bir kadar düşük (özellikle büyük moleküller için) ya da 50 veya daha fazla karakteristik bir değere sahiptir. Sonuç olarak, yararlı bir klonlama vektörünün, büyük miktarda rekombinant DNA molekülü elde etmek için hücrede çok sayıda kopyalarının bulunması gerekmektedir.

Konjugasyon ve Uyumluluk

Plazmitler konjugatif ve konjugatif olamayanlar olarak ikiye ayrılırlar. Konjugatif plazmitler, bir bakteri kültüründeki bir hücreden tüm düğer hücrelereyayılan integratif bir plazmitle sonuçlanabilen süreç olan, bakteri hücreleri arasındaki eşeysel konjugasyonu sağlama yeteneği ile karakterize edilir. Konjugasyon ve plazmit transferi, konjugatif plazmitlerde bulunan fakat konjugatif olmayanlarda bulunmayan bir takım transfer ya da tra genleriyle kontrol edilir. Bununla beraber, konjugatif olamayan bir plazmit, bazı şartlar altında, her ikisi de aynı hücre de mevcutsa, bir konjugatif plazmitle birlikte aktarılır.

Herhangi bir zaman da birden fazla farklı konjugatif plazmit dahil, birkaç farklı plazmit çeşidi tek bir hücrede bulunabilir. Aslında E.coli hücrelerinin bir kerede yediye kadar farklı plazmit içerdiği bilinmektedir. Aynı hücrede birlikte bulunabilmek için, farklı plazmitler uyumlu (compatible) olmalıdır. Eğer plazmitler uyumlu değillerse, o zaman bir ya da diğeri hücreden çok hızlı bir şekilde yok olacaktır. Farklı plazmit tipleri, birlikte bulunup bulunmamalarına dayanarak farklı uyumsuzluk (incompatibility)gruplarına ayrılır. Tek bir uyumsuzluk grubundan olan plazmitler, çoğunlukla değişik şekillerde birbirleriyle ilişkilidirler.

Plazmitlerin Sınıflandırılması

Doğal olarak bulunan plazmitlerin en kullanışlı sınıflandırması, plazmit genleri tarafından kodlanan özelliklere dayanmaktadır. Bu sınıflandırmaya göre plazmitlerin 5 tipi vardır.

1- Fertilite ya da ‘F’ plazmitleri yalnızca tra genleri taşırlar ve plazmitlerin konjugal aktarımını sağlama yeteneğinin ötesinde bir özelliğe sahip değillerdir.

2- Direnç ya da ‘R’ plazmitleri kloramfenikol, amfisilin ve civa gibi bir ya da daha fazla ajan için konak bakteriye direnç veren genler taşır. R plazmitleri, doğal popülasyon da yayılmalarının bakteri enfeksiyonlarının tedavisinde çok şiddetli yan etkileri olabildiğinden, klinik mikrobiyolojide çok önemlidir. Bir örnek yaygın olarak Pseudomonas’ da bulunan, ama pekçok bakteride de ortaya çıkan RP4’ dür.

3- Col Plazmitler, diğer bakterileri öldüren proteinler olan kolosinleri kodlar, örnek E.coli’ nin ColE1’ idir.

4- Parçalayıcı Plazmitler, konak bakterinin tolüen, salisilik asit gibi örneğin Pseudomas’ ın TOL’ u, olağan dışı molekülleri metabolize etmesini sağlar.

5- Virülans Plazmitler konak akteriye patojenlik kazandırır. Bunlar iki çenekli bitkilerde taç gal hastalığını indükleyen Agrobacterium tumefaciens’ in Ti Plazmitleri kapsar.

Bakteriler Dışındaki Organizmalarda Plazmitler

Her ne kadar plazmitler bakterilerde yaygınsa da, diğer organizmalarda asla bu kadar yaygın değildir. En iyi karakterize edilen ökaryotik plazmit, maya Saccharomyces cerevisia’ nın pek çok soylarından olan 2 µm halkanın keşfi, konak olarak çok önemli endüstriyel organizmayla genleri klonlamak için vektörlerin oluşumunu sağladığından büyük öneme sahiptir. Bununla beraber, diğer ökaryotlarda (örneğin ipliksi algler, bitkiler ve hayvanlar) plazmitleri arama hayal kırıklığı oluşturmakta ve pek çok yüksek organizmaların hücrelerinin basitçe plazmit barındırmadıklarından kuşku duyulmaktadır.

Kaynaklar;

1-GENE CLONIN AND DNA ANALYSIS AN INTRODUCTION FIFTH EDITION