HPLC Dedektör Seçimi — Ne, Nerede, Ne Zaman ve Nasıl
İdeal UV detektörü, hedef analitlerimizin varlığını, aynı anda detektör ölçüm hücresinde mevcut olabilecek arka plandaki eluent ve numune matriks bileşenlerinden etkilenmeden izlememize olanak tanıyacaktır.
İdeal UV detektörü, hedef analitlerimizin varlığını, aynı anda detektör ölçüm hücresinde mevcut olabilecek arka plandaki eluent ve numune matriks bileşenlerinden etkilenmeden izlememize olanak tanıyacaktır. Bu detektörün ilgilenilen analitlerin çok düşük düzeylerini ölçebilmesini, deneysel hata sınırları dahilinde stabil olmasını ve sıcaklıktaki değişiklikler veya kullanılan eluent sisteminin kimyasal yapısından dolayı yanıttaki değişikliklere duyarlı olmamasını istiyoruz. İdeal dedektör, analitin dağılması yoluyla bant genişlemesine katkıda bulunmayacak, bu da ayırma kalitesinin korunmasını zorlaştıracak ve dedektörün hassasiyetini azaltacaktır. Dedektör tepki süresinin (örnekleme hızı), yüksek verimli kromatografi biçimleriyle ilişkili çok dar tepe noktalarını düzgün bir şekilde kaydedecek kadar hızlı olması gerekir. Ayrıca dedektörün kullanımı kolay, anlaşılması kolay, mekanik olarak sağlam ve ucuz olmasını istiyoruz.
Tablo I, yaygın olarak kullanılan yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) detektörlerinin genel kabul görmüş bazı performans ölçümlerini göstermektedir; En yüksek seçiciliğe sahip olanların genellikle en iyi duyarlılığı verdiğini unutmayın. Dedektör tarafından ölçülen analitin fizikokimyasal özelliği veya özelliklerin kombinasyonu ne kadar spesifik olursa, potansiyel olarak girişim yapan türlerin aynı özelliklere sahip olma olasılığı da o kadar az olur; bu nedenle çok küçük miktarlardaki analit arka plandan ayırt edilebilir ve bu da iyi bir doğal hassasiyete yol açar. Moleküllerin nispeten genel özelliklerini ölçerken aynı zamanda nispeten yüksek hassasiyeti koruyan ve bu nedenle tüm analit türlerinin tespit edilmesi ve göreceli olarak belirlenmesi gerektiğinde çok faydalı olan buharlaşmalı ışık saçılımı tespiti (ELSD) ve yüklü aerosol tespiti (CAD) özellikle dikkate alınmalıdır. Bu dedektörler genellikle ilgili tüm analitlerin tespit edildiğinden emin olmak ve normalize edilmiş analit konsantrasyonlarını tahmin etmek için kütle spektrometresi dedektörleriyle birlikte kullanılır.
| Bazı yaygın HPLC tespit tekniklerinin özellikleri | ||
| Dedektör | Seçicilik | Hassasiyet |
| Refraktif İndeks (RI) | Düşük | 1-5 µg |
| İletkenlik (CD) | Düşük | 10-50 µg |
| Uv-Visisble (UV-Vis) | Orta | 0,5-1,0 ng |
| Elektrokimyasal (ECD) | Yüksek | 50-100 ng |
| Floresans (FLR) | Yüksek | 10-100 ng |
| ELSD | Düşük | 0,1-1,0 ng |
| CAD | Düşük | 0,1-1,0 ng |
UV tespiti, geniş uygulanabilirliği ve kullanım kolaylığı nedeniyle oldukça popülerdir. Analit, molekül içindeki atomların elektronik konfigürasyonuna göre belirli bir enerjiye (dalga boyu) sahip gelen ışığı emecektir ve doymamış, konjuge ve heteroatomlar içeren analitler büyük olasılıkla UV spektrumunun kullanılabilir bölgesindeki ışığı emecektir. Kromofor adı verilen bir maddeye sahip olan bu moleküller, bir akış hücresinde mevcut analit konsantrasyonuna karşı ışık absorbansı açısından oldukça doğrusal bir tepki verir ve nispeten basit Beer-Lambert yasasına tabidir. UV dedektörlerindeki ana kafa karıştırıcı faktörler, bir kromofor eksikliği, yüksek konsantrasyondaki analitler (göreceli ölçüm için dedektörün doğrusal aralığı içinde kalması için 1,5 AU veya daha az bir absorbansın tavsiye edilir), akış hücresi tarafından dağılma ve belirli etkenlerden kaynaklanan girişimdir. 210 nm’nin altındaki dalga boylarında sinyalleri izlerken eluent solventler ve katkı maddeleri. Beer-Lambert yasası, her bir analite özel olan bir molar soğurma katsayısı içerir ve saf referans standartları mevcut olduğunda, analite yönelik bir yanıt faktörü türetmek veya bilinen konsantrasyondaki standartlara karşı basit bağıl ölçümler yapmak için belirlenebilir. Saf referans standartlar mevcut olmadığında, benzer kimyadaki analitler için molar absorptivitenin benzer olduğunu varsaymak ve “sözde” standartlar kullanmak yaygındır. Her ne kadar yaygın olsa da, bu iyi bir uygulama değildir ve analitin doğru ve mutlak miktarının belirlenmesi gerekiyorsa alternatif bir tespit yöntemi aranmalıdır. Diyot dizili UV dedektörleri, geniş bir dalga boyu aralığı boyunca absorbansı ölçebilir ve bu nedenle, niteliksel analizi mümkün kılmak için kromatogramın herhangi bir noktasında UV spektrumları verebilir.
Floresans tespiti UV’ye benzer, ancak ölçülen özellik, belirli bir dalga boyundaki (enerji) UV radyasyonu tarafından uyarılan elektronların temel durumuna gevşemesinin neden olduğu floresanstır. Spesifik uyarma enerjisi ve spesifik gevşeme dalga boyunun kombinasyonu, bu dedektörü oldukça seçici ve dolayısıyla oldukça hassas hale getirir. Tabii ki, bu tespit yönteminin başarısı, ilgilenilen analitlerin floresans verebilmesine bağlıdır; bu, örneğin bir kromofora sahip olmak kadar yaygın değildir ve dolayısıyla dedektörün özgüllüğüne yol açan özellik, aynı zamanda şu özelliklere de yol açar: ana sınırlaması. Bu tespit tipi oldukça tercih ediliyorsa, floresanslı bir türevlendirme maddesinin kullanılması düşünülebilir.
Çeviri Kaynağı: chromatographyonline.com/view/hplc-detector-selection-what-where-when-and-how-0
