HPLC Sistemine Genel Bakış-Solvent Rezervuarı
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) sistemleri yüksek çözünürlüklü ayrımlar sağlamak amacı ile tasarlanmış ve optimize edilmiş sistemlerdir. HPLC teknolojisi 1900’lü yılların başında Tswett’in çalışmalarıyla başlayıp günümüzdeteknolojiden faydalanılarak yaygın bir şekild kullanılan son derece sofistike güvenilir ve hızlı sıvı kromatografi (LC) tekniklerine kadar neredeyse bir asrı aşkın bir sürede gelişti. Tswett yer çekiminden faydalandı ve dedektr olarak kendi gözünü kullandı. Bu çalışmalarda ayrım günler sürdü. Günümüzde ise kromatografi kolonlarının gelişimi ve aşağıda yer alan parçalar ile optimizasyonu sonucu kromatografi analizleri günlerden dakikalara kadar düştü. Bu parçalar şu şekildedir;
1-Solvent rezervuarı
2-Degazer
3-HPLC Pompası
4-Otomatik Örnekleyici
5-Kolon Fırını ve Kolon
6-Dedektör
HPLC sistemlerinde yukarıda yazılan modüllerin her biri kesintisiz bir akış sağlayacak şekilde çoğunlukla ya polimerik bir malzeme olan Polietereterketon(PEEK) ya da paslanmaz çelik malzemeden imal edilmiş kapiler borular ile bir birine bağlanmaktadır.
HPLC sisteminin ıslak bölümlerinin çoğu Polietereterketon(PEEK) ya da paslanmaz çelik malzemeden imal edilmiştir ancak bazı özel modüllerin belirli parçaları safir, yaku ve seramikten imal edilerek daha sağlam ve uzun ömürlü olmaları sağlanmıştır.
HPLC sisteminde pompadan sonra kolona kadar yüksek basınca maruz kalan kapiler boruların bu basnıca dayanabilecek kadar dayanıklı olmaları gerekmektedir.
- Solvent Rezervuarı;
Gerekli mobil fazı oluşturmak amacı ile kullanılacak olan solvent şişeleri bu alana konulur. Genellikle HPLC sistemlerinin en üstünde yer alırlar. Bu dizaynın başlıca sebepleri vardır. En önemli sebebi ise sıvıların yer çekimi altında aşağı yani degazer ve pompa yönünde sifonlanacak olmalarıdır.
Solvent rezervuar şişeleri kullanılırken dikkat edilmesi gereken bazı hususlar vardır;
- Solvent rezervuar şişeleri sıkıca kapatılmış olmalıdır. Sıkıca kapatılmamış şişelerden buharlaşma yolu ile organik solvent oranlarında azalma olacaktır. Bu da alıkonma sürelerinin değişmesi ve çalışan sağlığı açısından akut zehilenme gibi çeşitli problemlere yol açabilir. Solvent şişeleri sıkıca kapatılırken ilk boşaltımı (priming) önlemek amacı ile ufak bir delik bırakılmalıdır. Solvent şişelerinde ki buharlaşma mobil fazın efektif elüsyon gücünü azaltacak ve çıkış zamanlarında muhtelif değişimlere yol açacaktır. Bu tür değişimlerin önüne geçmek için rezervuara konulan mobil fazın uzun süreler boyunca tamamen bitmesini beklemek yerine taze hazırlanmış yeni bir mobil fazla değiştirilmesi önerilen bir uygulamadır.
- Solvent şişelerinin üs kısımları parafilm benzeri laboratuvar filmleri ile kaplanması uygun değildir. Bu tür filmler fitalat benzeri plastik türevleri içermekte olup buharlaşan mobil faz dolayısıyla eriyerek mobil faza karışabilir ve genel kromatografik baseline gürültüsünün artmasına neden olabilir. Özellikle kütle spektofotometreleri bu tür kirliliklere oldukça hassastır ve dikkat edilmezse fitalat kirlilikleri elde edilen spektrumunun temel pikini oluşturarak yanlış sonuçlar vermemize sebep olur ve çalışma hassasiyetini düşürür.
Özellikle tampon ve/veya iyon çifti reaktifleri içeren mobil fazlar süzülerek HPLC sistemine zarar verebilecek partiküler maddeler ortamdan uzaklaştırılmalıdır. Mobil faz hatlarına takılan filtreler bu uygulamayı destekler. Çalışmalarda mobil faz hatlarında filtrelerin takılı olmasına özen göstererek sistemi güvence altına almış oluruz. Mobil faz filtreleri genellikle sinterlenmiş camdan imal edilmiştir. Bu filtreler zaman zaman tıkanabilir. Bu gibi durumlarda 6M nitrik asit solüsyonu ile yıkanabilir. Yıkama işleminden sonra filtreyi asitten arındırmak amacı ile önce su ardından metanol ve en son su ile yıkayarak temizleme işlemi tamamlanmış olur. Bu işlemlerin ultrasonik banyoda yapılması uygun değildir. Sinterlenmiş cam kolayca kırılabilmektedir ve filtreleri tümüyle işlevsiz hale getirebilmektedir.
