Likit Kromatografisi Kolon Ömrünü Uzatma İpuçları

Kromatografik kolonların ömürleri kullanım ve bakım koşulları ile doğrudan ilişkilidir. En iyi koşullar altında bile likit kromatografi kolonları kimyasallar ve çeşitli partiküllere maruz kaldıkları için bozulur. Kolon kullanım ve bakım koşulları bu ömrü uzatmaya yöneliktir. Kolon ömrü kolonun yapısından çok maruz kaldığı kimyasal ve fiziksel etkiler ile belirlenir.

Kolonlar bazı analizlerde ister istemez kimyasal ve fiziksel etkilere maruz kalabilirler ve bu kaçınılmazdır. Böyle bir durumda analitik LC kolonunuzda maksimum ömür ve performans elde etmek ve kimyasal bozulmayı önlemenin bir kaç basit yöntem vardır.

1- Kolonun çalışma koşullarını öğrenin;

Satın aldığınız kolon ile beraber bir kullanım kılavuzu gelir. Bu kılavuzun kolon açılmadan önce çok iyi okunması ve gerekli talimatlara uyulması önemlidir. Sıcaklık, pH, kullanılabilecek tampon çözelti gibi çalışma koşulları genellikle bu kılavuzlarda yer alır. Bunlara dikkat edilerek kolon ömrü uzatılabilir. Ayrıca kolonun yıkama ve saklama koşulları için de bu kılavuzlardan faydalanılabilir.

Kolon üreticileri sağlamlık ve iyi performans için kolonları geniş bir çalışma aralığında test eder. Bu bilgi bir çok kolonun kullanım ve bakım kılavuzunda yer almaktadır. Bu kılavuzda “Column Use” bölümüne özellikle dikkat edin. Bu örnek hazırlama önlemlerini, pH aralığı yönergelerini, solventler hakkında bilgi ve aynı zamanda maksimum çalışma basıncı gibi konularda tavsiyelerde bulunur.

Özellikle kolonlarda çalışılabilecek mobil faz pH aralıkları kolon ömürleri ile yakından ilişkilidir. Örneğin; silika bazlı ters fazlı bir kolonda oda sıcaklığında pH 2-8 aralığı bir çok mobil faz için oldukça kararlıyken, hibrit-silika bazlı ters faz kolonları pH 1-12 çalışma aralığında daha kararlıdır. Bu nedenle kullanılacak mobil faz pH’sı dikkate alınarak kolonlar seçilmelidir. Bununla birlikte, sıcaklığın arttırılması özellikle dolgu maddesinin çalışma pH sınırlarına yaklaşıldığında kolon dolgu maddesini hızla bozarak ömrünü kısaltacaktır. Kolonda bulunan silika parçacıklarının çözünmesine sebep olan yüksek sıcaklık ve pH etkisi ile büyük ihtimalle kolon arızası yaşanacaktır. Yüksek sıcaklık ve pH etkisi sonucu kolon bozulması genellikle kolon girişinde sabit fazda bir boşluk oluşturarak piklerde çarpık tepe noktaları ve tepe noktalarında pik yarılmaları şeklinde gözlemlenir. Kolonda yüksek sıcaklıklarda çalışılması durumunda bu dikkate alınarak kolon ömrü uzatılabilir.

Kolon ömrünü etkileyen bir diğer etken ise hareketli fazda kullanılan tampon iyonlarının seçimidir. Fosfat tamponları yaygın olarak kullanılır fakat en iyi seçim değildir. TRIS veya sitrat gibi organik bazlı tamponlar ile daha iyi sonuçlar elde edilebilir. Genel olarak; organik bazlı tamponlar silis esaslı dolgu maddelerine karşı daha az agresiftir. Bununla birlikte tampon konsantrasyonuda kolon ömrünü etkiler. Düşük tampon konsantrasyonu kolon ömrünün uzamasına katkıda bulunur.

Bu kadar detay içerisinde zaman zaman analizde istenen resolüsyonun, tailingin vb. bir çok parametrenin sağlanabilmesi için uç noktalarda çalışılabilir. Bu gibi kritik durumlar için izlenebilecek en iyi yol kolon kullanım kılavuzunda ki önerileri takip ederek maksimum düzeyde uygulamaya çalışmaktır.

2-Kolon ilk açılış, dengeleme ve yıkama-saklama koşullarını doğru uygulayın;

Sıfır kolonların açılış koşulları kullanım kılavuzlarında yer almaktadır. Bu koşullarda belirli akış gradienti uygulayarak kolonların ilk kullanım için doğru açılması kolon ömrünü etkiler. Kolonlar bize ulaşmadan önce üretici tarafından test edilir ve saklama solventi ile yıkanarak gönderilir. Buda çoğu üretici tarafından kullanım kılavuzunda belirtilir.

Kullanımda olan kolonların her analiz öncesi hazırlık aşamalarından biri olan kolon dengeleme işlemi de oldukça önemlidir. Dengeleme zamanı mobil faz konsantrasyonu ve kompozisyonuna göre değişiklik gösterebilir. Genel olarak; daha yoğun mobil faz koşulları, daha seyreltilmiş mobil fazlara kıyasla daha az dengeleme zamanı gerektirir. Bunun en temel nedeni; sabit fazda daha düşük bir yüzey konsantrasyonu sağlayan seyreltik hareketli fazlar ile mobil faz ve sabit faz arasındaki kinetik etkileşimdir. Kolonun dengelenmesinde kilit nokta dengeleme zamanı değil mobil faz hacmidir. Genel olarak iyi bir kolon dengelemesi için kolon hacminin 5-10 katı bir mobil faz uygulanması önerilir.

Kullanılmış kolonların yıkanması kolon ömrünü etkileyen bir diğer parametredir. Özellikle tuzlu tamponlar kullanılan sistemlerde kolonun uygun şartlarda yıkanması ve bu şekilde saklanması önemlidir. Kolonda analizden kalabilecek safsızlıkların ve tuzların veya asit-baz bileşiklerinin silika yapıya zarar vermesini engellemek için uygun prosedürde kolonun yıkanarak organik (metanol, asetonitril vb.) ağırlıklı ortam ile saklanması kolon ömrünü uzatacaktır. Kolonlar analiz spesifik kullanılıyorsa ve  her gün veya bir kaç günde bir kullanılırsa ayırma işlemi için kullanılan mobil fazda bırakmak en uygun yöntem olacaktır.  Böylelikle dengeleme için harcanan zamandan tasarruf sağlanacaktır.

Normal faz kromatografi kolonları uzun dengeleme sürelerinden dolayı kullanılan mobil fazda bırakılabilir ve bir sonraki analiz için bu şekilde kullanılabilir. Burada dikkat edilmesi gereken en önemli husus kolonun en son bırakıldığı mobil fazın kesinlikle biliniyor olmasıdır. Normal faz kromatografi kolonlarında genellikle su ile karışmayan hekzan, heptan gibi organik solventler kullanıldığı için bu kolonların kayıtları ve takibi oldukça önemlidir. Aksi durumda su ile kullanılmaya çalışılan normal faz kolonu direkt olarak bozulacaktır.

Bunu önlemenin bir diğer yöntemi ise nadiren de olsa kullanılan hem su ile hem de organik solventler ile karışabilen izopropil alkol (İPA) ile kolonların yıkanması ve böyle saklanmasıdır. Bu başta da belirtilen kolon dengeleme süresini oldukça uzattığı için pek tercih edilmemekle birlikte, olası bir sulu sistemde kolon kullanılmasında emniyet sibopu görevi görmektedir. Ayrıca normal faz kolonlarının takip edilmesinde en etkili kolaylık ise bu kolonların analiz spesifik kullanılması ve bu şekilde depolanmasıdır. Böylelikle değişik analizlerde kullanılması önlenmiş ve kolon ömrü uzatılmış olacaktır. Bununla birlikte zaman tasarrufu sağlanmış olacaktır.

Kolonların sık sık ve gereksiz yıkanması da kolon ömrünü azaltan bir etken olduğu için bundan kaçınmak gerekir. Bu nedenle hem ters faz hem de normal faz kromatografisinde mobil faz ile saklama yöntemi uygulanabilir. Bu yöntem uzun süreli saklamalarda önerilmez. Aksine tuzların ve kolonda absorbe olabilecek diğer bileşiklerin uzaklaştırılarak kolonların saklanması önerilir. Burada kolonların gruplandırılması ve depolanması önem taşımaktadır.

3-Kolonlarınızı gruplandırın;

İlaç, gıda, çevre gibi rutin analiz laboratuvarlarında yoğun bir analiz temposu mevcuttur. Aynı analiz günlerce hatta haftalarca çalışılabilir. Ayrıca çalışma sıklığı da oldukça fazladır. Bu tür çalışma ortamlarında kolonların analiz bazlı gruplandırılması kolon ömrünü arttıran bir diğer etkendir. Kolonlar her koşul için ayrı bir kolon dengeleme ve kolon yıkama koşullarına tabi tutulurlar. Ayrıca her analizde çalışılan tampon pH değerleri ve kolon sıcaklıkları farklılık gösterecektir. İlk maddede belirttiğim, kolonların çalışma aralıklarına yakın noktalarda çalışarak stres koşullarına maruz kalmalarını engellemek adına sınıflandırma önem kazanmaktadır.

Sınıflandırmanın bir diğer avantajı da zamandan tasarruf sağlanmasıdır. Gerek kolonun şartlanması, gerekse stoktan bulunması böylelikle kolaylaşacaktır. Bunun yanı sıra kayıt takibini yapmak hem daha kolay hem de daha sağlıklı olacaktır.

4- Kolonlar için  doğru ve etkin depolama sisteminizi kurun;

Depolama koşullarının kolon ömrü üzerine çok azda olsa etkisi mevcuttur. Depolama şartlarında her uygulama alanı için çok farklı yöntemler mevcuttur. Burada ki temel yaklaşım kolaylıktır. Yani; depolama, lokasyon tespiti, kayıt ve takip kolaylığı önemlidir.

Depolama yaparken sabit fazın türünü dikkate alarak bir gruplandırma yapmaya başlayabilirsiniz. Bir diğer yöntem de analiz bazlı gruplandırma olabilir. Yani kolonu sadece kendi analizinde kullanmak ve bu şekilde depolamak olabilir. Bir çok şirket kendi stok takip ve depolama koşullarına bağlı olarak değişik varyasyonlarda bu işi yapmaktadır. Ama tüm varyasyonların temelinde kolay kullanım yer almaktadır. Sizde kendi sisteminizi bu temel üzerine tasarlayabilirsiniz. Önerim başta da belirttiğim depolama sisteminizi kurmaya sabit fazın türüne göre ayrım yaparak başlamanız. Bu size her anlamda kolaylık sağlayacaktır. Ayrıca kolonların kullanım ömürlerine azda olsa katkıda bulunacaktır.

Yukarıda bahsettiğim 4 maddeye bir çok madde daha eklenebilir. Bu maddeler rutin kullanımda genel olarak göz ardı edilsede kolon ömrünü en çok etkileyen etmenlerdir. Doğru takip edildiğinde gözle görülür bir kolon ömrü artışı sağlayacaktır. Kolon ömründe ki artış hem karlılığı hem de analiz güvenliğini arttıracaktır.