Pipet Seçimi ve Doğru Pipetleme Teknikleri
Doğru pipet seçimi ve doğru pipet kullanımı pre-analitik hatanın giderilmesinde oldukça önemlidir. Pipetlerin çalışmanın niteliğine göre çeşitli fonksiyonlara sahip olmaları gerekir. Bununla beraber analistin pipet kullanımı da oldukça önemlidir. Laboratuvarlarda kullanılan pipetleri 6 başlık altında inceleyebiliriz.
- Dereceli Pipetler: Camdan yapılmış değişken hacimlerde pipetleme imkanı sunan derecelendirilmiş pipetlerdir. Yıkanarak tekrar tekrar kullanılırlar.
- Hacimsel Pipetler: Genellikle camdan yapılmış, aynı ve sabit bir hacmin tekrarlanan çalışmalarında kullanılan pipetlerdir. Yıkanarak tekrar kullanılırlar.
- Pastör Pipet: Pastör pipetlerin baş kısmında bulunan pompalama ünitesiyle sıvıyı içine çekerler. Pompalama ucu ve gövdesi bir bütün halinde olan plastik pastör pipetler tek kullanımlıkken, pompalama ucu plastik ve çekme ucu cam olan iki parçalı pastör pipetlerin cam uçları yıkanarak tekrar tekrar kullanılırlar.
- Transfer Pipet: Bu pipetler dereceli pipetler gibidir ancak plastikten üretilmiştir ve tek kullanımlıktır.
- Hava Yer Değiştirmeli Pipetler: Sıvı pipetle temas etmez. Hassas analitik çalışmalarda çok düşük hacimlerden yüksek hacimlere kadar çalışma imkanı sunar. Tek kullanımlık pipet uçları ile kullanılırlar.
- Pozitif Yer Değiştirmeli Pipetler: Sıvı piston ve pipet ile temas halindedir. Pipet ucu ve piston tek kullanımlıktır.
Hava yer değiştirmeli ve pozitif yer değiştirmeli pipetler analitik çalışmalarda en sık kullanılan pipetler arasındadır. Bu pipetler çalışma sonuçlarımıza doğrudan etki ederler. Bu pipetler başlıca şu bölümlerden oluşur;
- Piston; Piston numuneyi pipet ucuna çekme ve boşaltma işlemlerini gerçekleştirir.
- Uç atıcı; İşlem tamamlandıktan sonra pipet ucunun atılması işine yarar.
- Hacim ayarlama topuzu; Çekilmek istenen sıvı hacminin ayarlanmasını sağlar.
- Hacim gösterge ekranı; Ayarlanan hacmi gösteren ekrandır.
- Plastik gövde; Pipet gövdeleri kullanım ve maliyet ergonomisi açısından plastik olarak üretilir.
- Uç atma kolu; Uç atıcı pistonun alt kısmında pipet ucu ile temas eden ve uç atıcının devamı niteliğindeki paslanmaz çelik yapıdır.
- Plastik şaft; Pistonun içerisinde yer aldığı ve pipet ucunun takıldığı alandır.
- Tek kullanımlık polipropilen uç; Numunelerin niteliğine göre çok farklı çeşitleri mevcuttur. Bunlar tek kullanımlık polipropilen plastikten üretilirler.
Doğru pipet seçimi sizi ideal sonuçlara ve ileri düzey tekrarlanabilirliğe ulaştırırken, ayrıca analiz ergonomisinin ve işlevselliğin sağlanması gibi faydalar sağlar.
Hava yer değiştirmeli ve pozitif yer değiştirmeli pipetleri yakından inceleyecek olursak genel nitelikleri şöyledir;
- Hava Yer Değiştirmeli Pipetler;
Genellikle µl-ml aralığında sıvı çözeltilerde oldukça doğru sonuçlar sağlar ve ekonomiktirler. Yüksek buhar basınçlı veya viskositeli ortamlar için uygun değildir.
Laboratuvarlarda en yaygın görülen pipet çeşitidir. Bu pipetlerde piston çekme konumuna getirildikten sonra pipet ucu sıvı numuneye batırılır, piston düğmesi optimum hızda bırakılır. Bu hareket sonucunda pipet pistonu pipet gövdesinden yukarı doğru çıkarken kısmi bir vakum oluşur ve sıvı numune yukarı yükselerek seçilen hacimdeki boşluğu doldurmuş olur.
- Pozitif Yer Değiştirmeli Pipetler;
Yüksek buhar basınçlı (uçucu), viskositesi yüksek (yapışkan, yoğun) veya aşındırıcı sıvılarda bu pipetler kullanılır. Çoğu çözeltide son derece hassas ve doğru sonuçlar verir.
Bu pipetler hava yer değiştirmeli pipetler kadar yoğun kullanılmasada laboratuvar ortamlarında sık görülürler. Bu pipetlerde seçilen hacim kadar boşluk oluşturmak amacıyla tek kullanımlık piston ve kapiler sistemi kullanılır. Piston doğrudan numuneye temas eder ve yukarı doğru hareket ederek numuneyi kapilerin içine çeker. Pozitif yer değiştirmeli pipetler sıvı çözeltilerde çalışırken en üst düzey hassasiyet ve doğruluk sağlar ancak yoğun, uçucu ve aşındırıcı çözeltiler için önerilir. Bunun en belirgin nedeni tek kullanımlık olan kapiler ve piston uçlarıdır. Hava yer değiştirmeli pipet uçları pozitif yer değiştirmeli pipet uçlarına göre oldukça ucuzdur. Bu nedenle aynı sonuçları sağlayacağı koşullarda hava yer değiştirmeli pipetler önerilir.
Hava Yer Değiştirmeli Pipetlerin Avantajları;
Pipetin sıvı ile temas etmemesi gereken steril çalışma koşulları için idealdir. Hava yer değiştirmeli pipetlerde sadece pipet ucu numune ile temas eder ve tek kullanımlıktır. Böylece analiz çapraz kontaminasyondan korunmuş olur. Pipet uçlarının hızlı bir şekilde değişmesi uzun süreli analizlerde hız avantajı sağlar.
Hava Yer Değiştirmeli Pipetlerde Sıvı Aktarımı;
Hava yer değiştirmeli pipetlerde sıvı aktarımı iki şekilde gerçekleştirilebilir;
- İleti Pipetleme;
İleri pipetleme numune çalışmalarında standart olarak kullanılan en yaygın yöntemdir.
- Pistonu ilk stop noktasına kadar basın ve basılı tutun. Ucu sıvının içerisine çekilecek hacme uygun derinlikte daldırın.
- Sıvının pipet ucuna çekilmesi için pistonu yavaşça bırakın.
- Pipeti sıvıdan çıkartın ve numune kabını dik ve pipet ucunu sıvının boşaltılacağı kabın iç çeperine 30° eğimli tutarak pistonu önce ilk stop noktasına kadar yavaşça bastırın. Sıvının tamamının boşaltılması için pistonu ardından ikinci stop noktasına kadar bastırın.
- Boşaltma işlemi bittiğinde pistonu bırakarak başlama pozisyonuna getirin.
- Ters Pipetleme;
- Piston sıvıya daldırılmadan hemen önce ikinci stop noktasına kadar basılın ve basılı tutulun. Ucu sıvıya yeterli derinliğe kadar daldırın.
- Pistonu yavaşça bırakarak sıvının pipet ucuna çekilmesini sağlayın. Pipeti sıvıdan çıkartın.
- Pipeti sıvıdan çıkartın ve numune kabını dik ve pipet ucunu sıvının boşaltılacağı kabın iç çeperine 30° eğimli tutarak pistonu önce ilk stop noktasına kadar yavaşça bastırın. Pipet ucunda bir miktar sıvı kalacaktır.
- Pipet ucunu kaptan çıkartın ve pistonu yavaşça bırakın. Pipet ucunda kalan sıvı ile birlikte atılır.
Pipetleme dikkat edilmesi gerekenler;
Pipet ucuna çekilen sıvının hacmi, yer değiştiren havanın hacmine bağlı olarak belirlenecek şekilde kalibre edilir. Bununla birlikte pipetleme yaparken meydana gelen en ufak çevresel değişkenler bile pipetlenen hacim üzerinde büyük etkiler meydana getirebilir. Bunlar başlıca şöyle sıralanabilir;
Basıç: Atmosfer basıncındaki değişiklikler pipetlemenin doğruluğunu etkileyebilir. Bu nedenle yeniden kalibrasyon gerekebilir.
Sıcaklık: Havanın hacmi sıcaklıkla doğrudan bağlantılıdır. Bu nedenle tüm cihazlar laboratuvar koşullarına dengelendikten sonra çalışma yapılmalıdır. Ayrıca pipet gövdesine ve ucuna uzun süre el ile dokunmaktan kaçınmalısınız. Bu pipet içerisindeki havanın ısınmasına neden olacaktır.
Pipet Ucu Daldırma Derinliği: Pipetleme sırasında pipet ucunun sıvıya daldırılacağı derinlik oldukça önemlidir. Hidrostatik basınç ucun üstündeki çözelti yüksekliği ile meydana gelir. Pipet ucu sıvıya çok derin bir şekilde daldırılırsa bu hidrostatik basıncı değiştirecek ve böylece uca çekilen sıvı miktarı değişecektir. Bu nedenle pipet kalibrasyonlarında kullanılan aynı derinlikler kullanılması önerilir. Aşağıdaki tabloda ideal derinlikler verilmiştir. Ayrıca iyi ayarlanmış daldırma derinliği ucun dışında tutunan fazla damlacıklardan ve numune içerisinde oluşan hava kabarcıklarının emilmesinden kurtulma imkanı sunar.
Ucun doğru derinliğe daldırılması mikro hacimli pipetlerde özellikle önemlidir ve doğruluğu %5’e kadar arttırabilir. Mikro hacimli pipetlerde uç 1-2 mm kadar, büyük hacimli pipetlerde ise 6-10 mm kadar daldırılmalıdır. Pipet ucu fazla derine daldırılırsa uçtaki gazın hacmi sıkışır ve çok fazla sıvının çekilmesine neden olabilir. Ucun yüzeyinde kalan sıvı da alınacak sonuçları bozabilir. Pipet ucu yeterince derine daldırılmazsa hava kabarcıkları oluşur ve hacim yanlış olur. Her iki durum da sonuçta istenen hacmin yanlış olmasına neden olur.
| Hacim Aralığı (µl) | Daldırma Derinliği (mm) |
| 0.1-1 | 1-2 |
| >1-100 | 2-3 |
| >100-1000 | 2-4 |
| >1000 | 3-6 |
Eğim: Pipetleme sırasında pipeti eğimli şekilde kullanmanız önerilmez. Bu önemli hatalar üretebilir. Hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği sağlayabilmek için her defasında aynı açıyla pipetleme yapmak zordur. Örneğin dikey konumda 1000 ml’ye ayarlanmış bir pipet, 45°’lik bir açıda 1003 ml bir hacim sağlayabilir. Bu nedenle pipetleme işleminde daima pipet dik konumda kullanılmalı ve boşaltma işlemi belirli bir açı ile yapılmalıdır.
Orhan ÇAKAN
Kaynaklar;
1.https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/news/are-you-using-right-micropipette
2.https://www.americanlaboratory.com/914-Application-Notes/1133-Increasing-Precision-When-Pipetting-Protein-Samples-Assessing-Reliability-of-the-Reverse-Pipetting-Technique/
3.https://andyjconnelly.wordpress.com/2017/02/12/practical-pipetting-a-guide/
4.https://www.mt.com/tr/tr/home/library/guides/rainin-pipettes/rainin-pipetting-handbook.html
