Bakteri ve Mantar Hücrelerinden Total DNA İzolasyonu

Bu yazımda siz değerli okurlara genetik çalışmalarının en önemli mihenk taşlarından biri olan bazı canlı gruplarından (Bakteri ve Mantar hücreleri) total DNA’nın nasıl izole edileceği ile ilgili güvenilir ve kesin sonuç veren bir deney protokolünden bahsedeceğim fakat deneye geçmeden önce konu ile ilgili kısa bir bilgi vermek istiyorum.

Herkesin bildiği üzere biyosferde yaşayan tüm canlı organizmalar yapılarında DNA ve RNA molekülleri içerir, bu moleküllerin rehberliğinde canlılar yaşamlarını sürdürür ve bulundukları habitat ile uyum içerisinde yaşayıp nesillerini devam ettirirler. Bilim insanları zaman içerisinde canlıların yapılarını daha iyi ve kesin bir şekilde anlayabilmek için organizmaların DNA ve RNA moleküllerinin incelenmesi gerektiğini keşfetmişlerdir. Bunun üzerine bazı özel teknikler geliştirerek canlılardan DNA ve RNA moleküllerini izole etmeyi, izole edilen molekülleri in vitro ortamda çoğaltmayı başarmışlardır. Bu özel tekniklerden biride PCR reaksiyonudur. Bu reaksiyonda in vitro ortamda (canlı organizma dışında) DNA molekülleri bazı özel maddeler (nükleotidler, özel tasarlanmış tek iplikli DNA parçaları(primerler), enzim, tampon çözelti ve çoğaltılacak DNA molekülü) aracılığı ile thermal cycler (sıcaklık döngüsü yapan bir cihaz) cihazında çoğaltılır ve gerekli genetik çalışmalarda kullanılır.

PCR(Polymerase Chain Reaction) yani polimeraz zincir reaksiyonu protokolünü gerçekleştirmeden önce bu teknikte bizim en önemli hammaddemiz olan canlılardaki DNA veya RNA moleküllerinin kontrollü şartlar altında bozulmaya maruz bırakılmadan izolasyonlarının sağlanması daha sonra ise agaroz jel veya SDS-PAGE teknikleri kullanılarak kontrol edilmesi gerekir.

DENEY PROTOKOLÜ:

Gerekli Malzemeler;

Mantar Hücreleri için

1- Mantar ekstraksiyon tampon çözeltisi (CTAB): 0.1 M Tris-HCl, pH:7.5, %1 CTAB(hekzadesil tri metil amonyum bromür), 0.7 M NaCl, 10mM EDTA, %1 merkaptoetanol ve kullanmadan hemen önce bu karışıma son konsantrasyonu 0.3mg/ml olacak şekilde proteinaz K da eklenir.

2- Kloroform ve İzoamil alkol karışımı: Kloroform 24 hacim izoamil alkol ise 1 hacim olacak şekilde çözelti hazırlanır yani 24 ml kloroform 1 ml izoamil alkol karıştırılarak 25 ml çözelti hazırlanır eğer daha fazla hazırlanacaksa oranlar sabit kalacak şekilde miktar arttırılabilir.

Bakteri Hücreleri için

1- Lizozim ve RNaz enzim karışımı: 10mg/ml lizozim enzimi, 1mg/ml RNaz enzimi, 50mM Tris-HCl (pH:8.0) bu karışım hazırlanıp -20 ˚C’de saklanır ama bir kere çözüldükten sonra tekrar dondurulmaz ve her deney için taze hazırlanır.

2- STET çözeltisi : %8 sükroz (çay şekeri), %5 Triton X-100, 50mM Tris-HCl (pH:8.0), 50mM EDTA (pH:8.0) bu karışım bakteri filtresi kullanılarak steril edilir ve +4 ˚C’de saklanır.

3- Son konsantrasyonu 20ug/ml olacak şekilde RNaz A ilave edilmiş TE tampon çözeltisi.

4- 4M Lityum klorür çözeltisi.

Mantar Hücrelerinden total DNA izolasyonu;

1- 0.2-0.5 gram mantar örneği sıvı azot içerisine atılır ve 1-2 dakika sonra çıkarılarak havan içerisinde ezilerek iyice öğütülür yada direk mantar örneği sıvı azota atılmadan havan içerisinde iyice ezilir ve 50 ml’lik tek kullanımlık santrifüj tüpüne eklenir.

2- 5 gram öğütülmüş mantar örneği üzerine 10 ml CTAB çözeltisi eklenir.

3- Bütün öğütülmüş örneği iyice ıslatmak için tüp hafifçe çalkalanır.

3- 50 ml’lik tüp 30 dakika boyunca 65 ˚C’lik su banyosunda bekletilir.

4- Tüp yarım saat sonra su banyosundan çıkarılır ve soğumaya bırakılır daha sonra üzerine 10 ml kloroform ve izoamil alkol den oluşan karışım eklenir.

5- Tüp hafifçe ve iyi bir şekilde karıştırılır 2000g de ve oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edilir.

6- Santrifüjden sonra tüpün üstündeki sıvı kısmın tamamı (süpernatant kısım) otomatik pipet yardımı ile başka bir tüpe aktarılır.

7- Yeni tüpteki sıvının üzerine 20 ml izopropil alkol eklenir ve tüp birkaç defa hafifçe ters düz edilir veya steril bir cam çubuk ile çözelti karıştırılır. Böylece total DNA molekülü tüpün dibine çökmeye başlar yada cam çubuk etrafında birikir. Tüp oda sıcaklığında yaklaşık 10-15 dakika bekletilir ara sıra ters düz edilerek veya karıştırılarak DNA’nın iyice çökmesi sağlanır ve 2000g de oda sıcaklığında santrifüj edilir ve süpernatant kısım atılır.

8- Çöken DNA molekülü %70’lik etil alkol ile iyice yıkanır ve gerekli santrifüj işlemleri yapılarak DNA molekülü etanolden uzaklaştırılır.

9- Tüpteki yıkanmış temiz DNA molekülü açık havada yaklaşık 5-10 dakika boyunca kurutulur. Daha sonra üzerine 1-5 ml arasında TE tampon çözeltisi eklenir ve DNA TE tampon içerisinde çözünmesi sağlanır gerekirse +4 ˚C’de bir gece bekletilir yada 65 ˚C’lik su banyosuna konulur. İzole edilmiş DNA örneği -80 ˚C’de stoklanır.

Bakteri Hücresinden total DNA izolasyonu;

1- Gece boyu kültüre alınmış olan bakteriler 5000rpm de oda sıcaklığında santrifüj edilerek çökmesi sağlanır ve üstteki süpernatant sıvı atılır.

2- Çökmüş bakteri peletleri üzerine 300 µl STET tampon çözelti ve 30 µl lizozim ile RNaz enzimlerinden hazırlanmış karışım eklenerek bakterilerin çözünmesi sağlanır.

3- Karışım 1 dakika 15 saniye kaynatılır.

4- Kaynatıldıktan sonra 15000 g’de oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj edilir.

5- Süpernatant kısım alınır ve 150 µl STET ile doyurulmuş fenol ile ekstraksiyon yapılır.

6- Tekrar santrifüj edilir ve süpernatant alınır ve üzerine tüpteki hacmin 10 da biri kadar(1/10) 4M otoklavlanmış lityum klorür çözeltisi eklenerek buz üzerinde 5 ila 10 dakika kadar bekletilir.

7- Tüp buz üzerinden alınarak tekrar santrifüj edilir ve süpernatant kısım alınarak yeni tüpe aktarılır. Tüp içerisinde bulunan sıvı miktarı kadar izopropil alkol eklenir ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletilir.

8- 15000 g’de oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj edilir ama DNA peleti gözükmez.

9- %80’lik etil alkol ile pelet yıkanır ve tekrar santrifüj yapılarak etil alkol uzaklaştırılır. DNA molekülü oda sıcaklığında 5 ila 10 dakika kurumaya bırakılır. ÖNEMLİ NOT: Burada önemli bir nokta yıkama işlemi için saf etil alkol kullanılmamalıdır çünkü saf etil alkol yıkama sırasında Triton X-100 isimli deterjan maddesinin de çökmesine sebep olur buda DNA molekülünde parçalanmalara ve kontaminasyona(kirliliğe) sebep olur.

10- Etil alkol tamamen uzaklaştırıldıktan sonra DNA çökeltisi TE tampon içerisinde çözülerek -80 ˚C’de  stoklanır.

Değerli araştırmacılar yukarıda sizlere yüksek güvenirlikte bir protokolün tüm detaylarını sunmaya çalıştım. Yukarıdaki protokol dikkatli bir şekilde uygulanırsa istenilen saflıkta DNA molekülleri elde edilebilir. Daha sonraki yazılarımda sizlere farklı farklı organizmalardan da DNA ve RNA izolasyonlarının nasıl gerçekleştirileceğinden ve bunların tanımlanmasından bahsedeceğim.

 

Ferhat ÖCAL

 

Kaynakça;

1-John M.S. Bartlett, David Stirling, Methods in Molecular Biology, volume:226, PCR Protocols (second edition), Humana Press Inc., Totowa, NJ