DNA Mikroarray Teknolojisi

Bir mikrodizi, kantitatif ( gen ekspresyonu ) veya niteliksel ( diagnostik ) verileri üretmek için hedef moleküller ile problanabilen mikroskobik özelliklerin ( yaygın olarak DNA )  derlemesidir. Mikroarray tekniğinin ilk girişimleri Shalon ve Schena tarafından gerçekleştirilmiştir.

DNA Mikroarray’i cam, plastik veya silikon çip gibi katı olan bir yüzeye tutturularak sıralı bir şekilde (array) oluşturulmuş mikroskobik DNA spotlarıdır. Yüzeye tutturulan DNA parçaları ( genellikle 20-100 nükleotid uzunluğunda ) prob olarak tanımlanmaktadır.

Mikroarray teknolojisi, DNA’nın bir substrata bağlanıp bilinen bir gen ya da fragment ile prob hazırlanması şeklinde tanımlanabilecek ‘’Southern Blotting’’ tekniğinden türetilmiştir. Bu teknikte membran yerine camın kullanılması, radyoaktivitenin yerini flouresan işaretlerin alması ve bağlanmayı sağlayacak olan yöntemlerin hassasiyetiyle çalışmaların verimi ve elde edilen bilgilerin miktarı artmıştır.

Mikroarray’lerin Kullanım Alanları

• Mutasyon analizleri
• Gen ifade profillerinin çıkarılması
• Polimorfizm analizleri
• Dna dizi analizi
• Evrim çalışmaları
• Potansiyel terapötik ajanların bulunması, geliştirilmesi, optimizasyonu ve klinik değerlendirilmesi

Mikroarray’lerin Üretimi Ve Çalışma Prensibi

Mikroarray’lerin üretiminde farklı yöntemler kullanılabilmektedir. Bunlar; cam lamlar üzerine ince uçlu iğnelerle baskı; önceden hazırlanmış maskelerle fotolitografi, dinamik mikroayna cihazları ile fotolitografi, ink-jet baskı vb. yöntemlerdir.

Mikroarray çipleri temel olarak iki şekilde hazırlanmaktadır;

• On-chip Oligonucleotide Synthesis (Çip üzerinde oligonükleotid sentezi); DNA ya da gen parçaları direkt olarak cam maddenin üzerinde sentez edilir. Genel olarak fotolitografi yöntemi kullanılmaktadır.

Fotolitografi yöntemi; Probun yüzeyini normal şartlar altında ışığı geçirmeyen bir madde (maske) kaplanır. Hibridizasyondan sonra UV ışığı altında hibridize olmuş bölgeler bu maddeyi delerek kendilerini belli ederler ve hibridize olmayan bölgeler ise karanlıkta kalır.

 

Fotolitografi yöntemi ile çip üzerinde oligonükleotid sentezi

• Direct DNA Deposition ( DNA’nın direkt olarak yüzeye bırakılması ); Bu teknikte genomik DNA’nın parçaları fiziksel olarak cam yüzeydeki yerlerine bırakılır. Bu yöntem Stanford Üniversitesi’nden Pat Brown’un labaratuvarında tasarlanmıştır.

 

Stanford nçiplerinin DNA fragmentleri; Genlerin PCR amplifikasyonuyla elde edilip, cam film üzerine robotic spotting yöntemi ile yerleştirilmesiyle elde edilmektedir. PCR ürünleri cam film üzerine yaklaşık 2 cm2 bir alana noktalar halinde yerleştirilir. Her bir PCR ürününün yerleştirildiği bölge ve içerdiği DNA dizisi kesin olarak bellidir. Daha sonra ise slayt üzerindeki DNA’lar kurutulur (100 °C de 2 sn), sabitlenir (UV cross-linking), ve denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir ( 95°C de 2 dk). Hazırlanan çipler, işaretlenmiş cDNA fragmentleriyle bağlanmak üzere kullanılır.

Gen array deneyleri tipik olarak farklı doku ya da koşullardaki veya bir uygulamadan sonraki gen ekspresyon düzeyini tayin etmek amacıyla kullanılmaktadır. Bu amaçlar doğrultusunda öncelikle çalışılacak konuya göre farklı dokular, koşullar ya da zamanlar göz önünde bulundurularak RNA izolasyonu yapılır.  RNA örnekleri seyreltilerek her bir örneğin eşit yoğunlukta olması sağlanır. Asıl RNA popülasyonundaki her mRNa molekülü için bu moleküle komplementer olan tek iplikli işaretlenmiş bir cDNA hazırlanır. Belli bir mRNA’nın yoğunluğu arttıkça cDNA miktarı da artar.

Problar, genellikle işaretlenmiş nükleotidlerin varlığında mRNA’nın tek iplikli cDNA’ya reverse transkripsiyonu ile üretilir. Bu nedenle, işaretli olan prob, aslında mRNA popülasyonunu temsil eden bir cDNA molekülleri popülasyonudur. Tek iplikli bir prob oluşturmak için RNA, mRNA’daki polyA ucuna komplementer olan oligo dT primerleri, reverse transkriptaz ve işaretlenmiş nükleotidler içeren bir reaksiyon karışımına konur. Genellikle işaretlenmiş nükleotidler Cy3 (yeşil) ve Cy5 (kırmızı) gibi flouresan işaretlerle ya da kimyasal luminescent saptama ile saptanabilen digoksijenin (DIG) ile etiketlenmiştir. Ele alınan bir klondaki hibridizasyon miktarı, ilgili gen için bulunan mRNA miktarına karşılık gelir.

Gen array’i deneyleri bazen ‘’revers northerns’’ olarak da adlandırılabilmektedir. Northern blot’da, RNA bir filtre üzerine bir prob yardımı ile blot edilir ve belli bir mRNA türünü ayrı bir bant ya da spot olarak tespit etmektedir. Gen array hibridizasyonunda ise cDNA’lar bir filtre ya da lam üzerine spotlanır ve bir mRNA popülasyonundan elde edilen bir prob yardımı ile hibridize edilir. Bu tarz çalışmalara için cDNA’lar genellikle bir EST çalışması ile elde edilir. Array’lerde yaklaşık 500.000 kadar spot bulunabilmektedir. Her bir probun işaret ile inkorporasyon ölçülür ve hepsinin yoğunluğunu eşitlemek için seyreltilirler. Genellikle, denenecek her bir prob için birer kopya filtre ya da Mikroarray hazırlanır. Problar her array ile ayrı ayrı hibridize edilir.

Filtre array’ler prob ile inkübe edilir ve Southern ya da Northern blotting’deki gibi yıkanmaktadır. Cam Mikroarray’ler için hibridizasyon bir coverslip altında yapılır ve lamlar yıkama solüsyonuna batırılarak yıkanır. Hibridize edilmiş prob DIG işaretleme için kimyasal luminesans, Mikroarray’ler için de doğrudan UV fluoresans ile tespit edilir.

 

Mikroarray Tipleri

1. Oligonükleotid Mikroarray’leri;

Olginükleotid Mikroarray’lerinde problar sekansı bilinen ya da tahmin edilen mRNA’lara uygun olacak şekilde dizayn edilir. Bu tip dizaynların bazılarına ticari olarak (Affymetrix, GE Healthcare vb.) erişmek mümkündür. Bu Mikroarrayler gen ifadesinin kesin değeri ile ilgili tahminler vermektedir. Bu nedenle iki durumun karşılaştırılmasında iki ayrı Mikroarray kullanmak gerekmektedir.

Array’deki her bir geni temsil etmek üzere genellikle 25-70 nükleotid uzunluğunda oligonükleotidler kullanılır. Daha küçük boyutlarda prob bağlama etkinliği daha düşük olmaktadır. Bununla birlikte küçük oligonükleotidlerin özgüllüğü daha fazla olmaktadır. 70 nükleotidden daha uzun olanlarda ise sinyalde çok küçük bir artış olmaktadır. Oligonükleotidler her seferinde yeniden sentezlendiği için cDNA’larda olduğu gibi başka sekanslardan kontaminasyon söz konusu değildir.

2. Spotlu Mikroarray’ler;

Spotlu Mikroarray’lerde problar oligonükleotid, cDNA veya mRNA’lara karşılık gelen PCR ürünlerinin küçük parçaları olabilir. Bu tip array’lerde genellikle iki farklı boya ile işaretlenmiş, karşılaştırılacak iki örnekten ( hasta ve kontrol ) gelen cDNA ile hibridize edilmiştir. Örnekler karıştırılıp tek bir Mikroarray’e hibridize edilebilir. Lazer ile taranması sonucunda up-regulated genler bir seferde görülebilir. Dezavantajı ise gen ifadesi düzeyinin kesin olarak gözlenememesidir.

Spotlu Mikroarray

Tipik bir Mikroarray çalışmasına örnek olarak Stanford Üniversitesi’nden P.Brown’un çalışması örnek olarak gösterilebilir. Yapılan bu çalışmada cDNA probları galaktozlu ve glukozlu ortamlarda yetiştirilen maya hücrelerinden elde edilmiştir. Farklı problardan gelen sinyalleri birbirinden ayırmak için farklı flouresans özellikteki etiketlerle ( Cy3-Cy5) işaretlenmişlerdir. Array’in biri Cy3 ve diğeri Cy5 olmak üzere iki kere lazerle taranmış olup böylece iki boyanında oranının ve dolayısıyla iki farklı yetişme ortamındaki transcript oranının saptanabileceği iki parçadan oluşan bir görüntü elde edilmiştir. Pseudocolor görüntülerinde, array’de galaktoz varlığında daha güçlü ifade edilen genleri temsil eden spotlar yeşil, glukoz varlığında daha güçlü şekilde ifade edilen genleri temsil eden spotlar ise kırmızı, her iki koşulda ifade edilen genler ise sarı renk ile gösterilmiştir.

3. Genotip Mikroarray’leri;

Dna Mikroarray’leri belirli bir genom dizisini okumada da kullanılabilir. SNP Mikroarray’ler bireylerde ve popülasyonlar da genetik varyasyonu belirlemek için kullanılan özel bir çeşit DNA Mikroarray tipidir. Genetik çeşitlilikten ve genetik hastalıklara yatkınlıktan sorumlu olduğu düşünülen tek nükleotid polimorfizmlerini (single nucleotide polymorphisms- SNP) belirlemede kısa nükleotid array’leri kullanılabilmektedir. Genel olarak genotip belirleme olarak adlandırılan bu tip Mikroarray uygulamaları adli tıp çalışmalarında, hastalıklara genetik yatkınlığın hızlı bir şekilde bulunması çalışmalarında ya da DNA temelli ilaç adaylarının tanımlanmasında kullanılabilmektedir.

SNP Mikroarray’leri ayrıca kansere neden olan somatik mutasyonların, özellikle de heterozigot kaybının ya da DNA bölgelerinin artan ya da kaybedilen (delesyon) profillerinin belirlenmesinde de kullanılmaktadır. Yeniden sekanslama array’i bireylerdeki genom kısımlarının dizisini çıkarmak için geliştirilmiş bir başka array çeşididir. Bu array tekniği germline mutasyonları veya kanserdeki somatik mutasyonları belirlemede kullanılabilmektedir.

 

 

Şevval ÇAKIR

 

Kaynaklar;

1-Mikroarraystation.com/

2-ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/Mikroarrays.html

3-bio.davidson.edu/Courses/genomics/chip/chip.html

4-thermofisher.com/tr/en/home/life-science/Mikroarray-analysis.html

5-Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. (1995). Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA Mikroarray. Science. Oct 20; 270 (5235): 467-70.