Gen Tedavisi
Eksik ya da hatalı protein üretimine neden olan, bozuk geni taşıyan hücreye normal olan geni yerleştirme yöntemine ‘’ Gen Tedavisi ‘’ denir. Gen tedavisi, hastalıkları nükleotid düzeyinde tedavi etmeyi amaçlamaktadır. Gen tedavisinin en yaygın biçimi, mutasyona uğramış bir genin fonksiyonunun düzenlenmesi için belirsiz bir genomik bölgeye fonksiyonel genlerin bir vektör aracılığıyla eklenmesidir.
Gen tedavisinde sağlıklı geni hücrelere vermek ve gen hasarlarını onarmak için birkaç yöntem kullanılmaktadır. Bu yöntemler;
- İnsersiyon: Viral vektörler aracılığı ile normal rasgele olarak hücre genomuna entegrasyonudur. Bu durumda gen parçaları rasgele olarak genoma girdiği için DNA hasarlarına sebep olabilmektedir.
- Yer Değişimi ( Gen Cerrahisi ); Normal genin homolog rekombinasyon ile istenen, belli bir lokusa yerleşmesini sağlar. Bu yöntemin gerçekleşme olasılığı çok az olmasına rağmen gen parçası spesifik bir bölgeye yerleştiği için DNA hasarı en aza indirgenmektedir.
- Tamir; anormal genin ters mutasyonla tedavi edilmesidir. Örneğin A>C C>A. Bu yöntem genellikle nokta mutasyonları nedeni ile ortaya çıkan hastalıkların tedavisinde kullanılabilmektedir. Bu durumda mutasyona uğramış olan gen, nukleazlar ( çinko parmak, TALEN ve CRISPR/Cas9 ) aracılığıyla hücrenin doğal tamir mekanizmaları tetiklenip ters mutasyon ile düzeltilmektedir.
- Gen Eklenmesi ( İntihar Gen Tedavisi ); normal durumlarda hücrede bulunmayan ve eksprese olmayan hücrede bulunmayan ve eksprese olmayan genin istenilen zaman ve istenilen hücrede ifadesini sağlamak için uygun hücreye transferi işlemidir.
- Gen tedavisi çalışmalarının çoğu, belli başlı ortak basamaklardan oluşur. Bu basamaklar,
- Hastalığa neden olan genin belirlenmesi,
- Sağlam genin klonlanması,
- Uygun bir vektör seçimi veya gen kümesinin (gen kasetleri) düzenlenmesi,
- Genin hedeflenen hücrelere transferi ve protein ifadesinin sağlanması,
- İşlenmiş hücrenin seçimi ve hastaya nakli (İn vitro gen tedavisi durumunda),
- Olası yan etkilerin belirlenmesi.
Gen Tedavisinin Ana Kategorileri
- Eşey Hücre Gen Tedavisi
İnsan zigotunda, eşey hücrelerinde genetik modifikasyon teorik olarak mümkün olmaktadır. Hayvanlarda uygulanan teknolojileri prensip olarak insanlara uygulanabilmektedir. Ancak burada amaç, insan transgenezinden ziyade germline gen tedavisidir.
Eşey Hücre Gen Tedavisinde İzlenen İşlem Basamakları
- Totipotent embriyonik hücre izolasyonu,
- Embriyonun genetik yapısının belirlenmesi,
- Embriyonik kök hücrelerin kültüre edilmesi,
- Embriyonik hücrelere genetik materyalin transferi,
- Transfekte edilmiş geni alan hücrelerin seçimi,
- Hedef geni genomda entegre olmuş hücrelerin seçilmesi
- İşaretleyici kaldırılması
- Genomik bütünlüğü teyit etmek,
- Nukleus transferi,
- Anneye reimplantasyon
Eşey hücre gen tedavisinin amacı tedavi edici geni hem vücut hemde eşey hücrelerine aktarmaktır. Sonuç olarak hem kişinin hastalığı ortadan kaldırılmış olur hem de düzeltilmiş genotipe sahip gametler oluşturularak sağlıklı nesiller elde edilecektir. Eşey hücre gen tedavisi yönteminde, vücudun tüm hücrelerini oluşturabilen erken dönem embriyo, gamet ve zigotta apılan genetik dönem embriyo, gamet ve zigotta yapılan genetik değişiklerle uygulandığı için bu değişiklikler gelecek nesillere aktarılabilmekedir.
- Somatik Hücre Gen Tedavisi
Somatik hücre gen tedavisi uygulamasında, tedavi edici gen somatik hücrelere transfer edilmektedir. Hastanın kemik iliği, kan ve deri hücrelerine gen transferi, vücut hücresi gen tedavisi kategorisinde yer alır. Sonuçta genler düzeyinde yapılan değişiklikleri ve gen tedavisinin farklı düzeyinde yapılan değişiklikleri ve gen tedavisinin farklı etkileri sadece vücut hücreleri düzeyinde kalır, eşey hücrelerine ve ardından gelecek nesillere aktarılmaz.
Gen Tedavisinde Kullanılan Gen Aktarım Amaçları
Genlerin alıcı hücreye aktarılması labaratuvar ortamında ( ex vivo ) veya hastanın vücudunda ( in vivo ) gerçekleştirilebilir.
Ex Vivo Gen Tedavisinde; hücreler hastadan alınır ve hücre kültürü ortamında çoğaltılarak klonlanan gen aktarılır. Gen aktarımının gerçekleştiği hücreler seçilerek hücre kültüründe in vitro olarak çoğaltılır ve hastaya verilir. Hastanın bağışıklık sistemi tarafından bu hücrelerin red edilmemesi için mümkün olduğunca hastanın kendi hücreleri (otolog hücreler) tercih edilmektedir.
İn Vivo Gen Tedavisinde; alıcı hücrelerin in vitro kültürünün yetersiz olduğu (ör. Beyin hücreleri) veya kültürü yapılan hücrelerin hastaya re-implantantının etkili bir şekilde yapılamadığı durumlarda tek seçenektir. Transfer edilen gen doğrudan hedef dokuya veya genel dolaşıma verilebilmektedir ancak aktarım için kullanılan vektör sadece hedeflenen hücreler tarafından alınacak şekilde veya sadece hedeflenen hücrelerde gen ifadesi olacak şekilde tasarlanmış olmalıdır. Bu yöntemde geni almış veya ifade eden hücreleri çoğaltma ve seçme şmkanı olmadığı için in vivo gen tedavisinin başarısı gen aktarımı ve ifadesinin ( ekspresyonunun ) etkinliğine bağlıdır.
Gen Tedavisinde Kullanılan Vektörler
Hedef hücrelere tedavi edici geni sunmak için kullanılan taşıyıcılara ‘’vektör’’ denilmektedir. Gen tedavisi başarısı büyük ölçüde gen parçasını aktarabilen vektöre bağlıdır. Uygun bir vektör, DNA parçasını seçimli ve verimli bir şekilde, en az toksisite ile hedef hücrelere sunabilmektedir. Virüsler hücre transdüklenmesi açısından verimlidir, ancak insanlarda virüsün kullanılması ile ilgili güvenlik endişeleri viral olmayan taşıyıcı sistemleri alternatif hale getirilmiştir. Son zamanlarda,hedef hedef hücrelere gen aktarılması için çıplak DNA kullanılmaktadır. Çıplak DNA’nın kullanılması ise basit basit ve güvenli bir yöntem olmasıdır. çıplak DNA tekniği ile çeşitli fiziksel teknikler birleştirilerek verimliliği ve hücre spesifitesi arttırılmıştır. Buna örnek olarak ‘’ Elektroporasyon, Gen Tabancaları, Ultrason, Hidrodinamik Basınç ve Lipozom ‘’ teknikleri örnek olarak verilebilmektedir.
İdeal Vektörlerin Özellikleri;
- DNA parçalarını aktarabilmesi için yeterli kapasiteye sahip olması,
- Kolaylıkla yüksek konsantrasyona ulaşabilmeli,
- Hedef dokuya spesifik olmalı,
- Stabil olmalı,
- İmmun yanıt oluşturmamalı, toksik olmamalı,
- Etkinliği yüksek olmalı,
- Uzun süreli gen ifadesi sağlamalı.
Transfeksiyon Yöntemleri
Dışarıdan verilen tedavi edici gen parçacıkları çeşitli yöntemler ile tedavi edilecek hücrelere aktarılabilir. Bu stratejiler 2 ana kategoride yer alır; fizikokimyasal yöntemler ve biyolojik yöntemler. Fizikokimyasal yöntemler, DNA’nın doğrudan hücreye enjeksiyonudur. Örneğin elektroporasyon, gen tabancası (balistik gen enjeksiyonu), sonoporasyon gibi fiziksel yöntemler ya da lipozom ve dendrimerler gibi kimyasal yapılar kullanılır. Bu yöntemlerde fizikokimyasal kurallar kullanılarak DNA parçaları hücre içine sokulmaktadır. Örneğin gen tabancası yönteminde ilk DNA parçaları altın ya da tungstenden oluşan 1-3 mikron boyutunda mikroparçacıklar ile örtülür ve daha sonra bu DNA/nanopartikül parçaları güç üreten bir cihaza yüklenir. Parçacıkların hız kazandırılarak, hücre zarını delip, sitoplazmaya girmesi sağlanır. Sitoplazma içinde nanopartiküller DNA’dan ayrılıp DNA nukleusa girer ve görevini yapar. Fiziksel yöntemlerin avantajı basit bir yöntem olmasıdır. Ancak düşük verimlik ve in vivo olarak kullanım zorluğu dezavantajlarıdır. Daha sonra terapötik DNA parçaları in vitro koşullarında endonükleaz ve ligaz enzimlerin yardımıyla virüs genomunda entegre olup, paketleyici memeli hücre hatlarında virüs kapsitler içinde paketlenip terapötik virüs partikülleri oluşturur. Paketleyici memeli hücreler santrifüj ile çöktürüp, çeşitli yöntemler ile parçalanıp ve virüs partiküller izole edilecektir. Retrovirüs aracılı gen terapisi için iki virüs yapısının kullanılması gerekir. Bunlardan biri tedavi edici vektördür ve klonlanmış sağlam geni ve paketleme sinyalini taşır; diğeri ise uzun terminal tekrarları (LTRs) ile çevrelenmiş retrovirüsün üç yapısal genini taşıyan virüs RNA’sıdır ve paketleme sinyali içermez. Yapısal vektör kapsid proteinlerinin üretilmesi ve virüsün montajı için gereklidir; gag, pol ve env genlerini taşır. (GAG: matriks proteini, POL: revers transkriptaz enzimi, ENV: envelope proteinini kodlar). Vektör, paketleme sinyali içermediği için üretilen virüs partiküllere giremez ve hastayı enfekte edemez. Her iki virüs yapısı aynı anda mevcut olduğunda, klonlanmış geni içeren tedavi edici vektör, kapsit içine paketlenir. Tedavi edici vektörün kapsit içine paketlenmesi, uygun bir hücre kültürü kullanılarak gerçekleştirir; bu hücre hattına “paketleme hücre hattı” denir. Gag, env ve pol genlerinin delesyonu vektör replikasyonunu defektli hale getirir ve bu yüzden paketleme hücre hattı kullanılır.
Viral vektörlerin bazı dezavantajları vardır;
Retrovirüs; bölünmeyen hücreleri enfekte edemez,
Adenovirüs; olumsuz immünolojik yanıt gösterir,
Herpesvirüsün; sitotoksik etkisi vardır,
Adeno-assosiye virüs; kısıtlı yabancı genetik materyal taşıyabilme kapasitesine sahiptir.
Tüm virüslerin ortak dezavantajı genin yanlış bir yere yerleşme tehlikesidir. Bunun nedeni de virüslerin rastgele olarak genoma entegre olmasıdır. Bu şekilde konakçı hücrenin diğer genlerini keserek kansere ya da başka bozukluklara yol açabilir. Birden fazla hücre çeşidini enfekte edebilme özelliği ve eşey hücrelerine girme ihtimali, onların diğer dezavantajları olarak bilinir. Ancak günümüzde bu dezavantajları ortadan kaldırmak için çeşitli araştırmalar yapılmaktadır. Virüse ait kapsit proteinlerini değiştirip spesifik bir dokuya, örneğin karaciğer hepatosit hücrelerine girebilme özelliği kazandıran viral vektörlerin elde edilmesi gibi çalışmalar yapılmaktadır.
En Sık Kullanılan Viral Vektörler Ve Özellikleri
Şekil: Klinik gen tedavi deneylerinde kullanılan viral vektörler
Klinik Gen Tedavisinde Denenen Başlıca Hastalıklar;
Şevval ÇAKIR
Kaynaklar;
- https://www.researchgate.net/publication/321846363_Gen_tedavisinin_temel_ilkeleri_ve_son_gelismeler
- http://genetherapy.akdeniz.edu.tr/assets/files/TG_GenTedavisi.pdf
- http://norosirurji.dergisi.org/pdf/pdf_TND_50.pdf
- http://www.journalagent.com/turkhijyen/pdfs/THDBD_64_1_35_50.pdf
