Prokaryotlarda CRISPR-Cas9 Sistemi

Crispr Tekniğinin Kullanımı

Crispr Tekniğinin Kullanıldığı Organizma Ve Kültürler;

• Prokaryot Canlılar
• İn Vitro Ortamlarda
• Bitkilerde
• Molde Deney Hayvanlarında
• Embriyolarda
• İnsanlarda

Kullanılmıştır.

CRISPR Cas-9 Sistemi

Patojenler, özellikle virüsler, gelişmiş canlılarda olduğu kadar tek hücreli canlılar için de tehdit oluşturmaktadır. Bu bakımdan tek hücreli canlıların da virüslere karşı genomlarını korumak için bir savunma sistemine sahip olmaları gerekmektedir.

Yirmi yıl öncesine kadar, bakterilerin bağışıklık sistemi olarak sadece doğal restriksiyon enzimlerine sahip olduğu biliniyordu. Ancak son yıllarda yapılan çalışmalarda, bakterilerin de karşılaştıkları patojenlere karşı kazanılmış bağışıklık sistemi geliştirebildikleri gösterildi. Günümüzde CRISPR-Cas olarak adlandırılan bu sistemin arkelerin %84’ünde ve bakterilerin ise yaklaşık %45’inde bulunduğu bilinmektedir.

Prokaryot canlılarda ‘’ düzenli aralıklarla bölünmüş kısa palindromik tekrar kümeleri’’ adı verilen belirli DNA bölgeleri kazanılmış bağışıklık sisteminin temelini oluşturmaktadır.

CRISPR bölgelerinin en belirgin özelliği, içerdikleri tekrarlayan kısa DNA dizileridir.

Palindromik olan bu kısa DNA bölgeleri 5’den 3’ne ve 3’den 5’e, her iki yönde de aynı okunan dizilerdir.

Palindromik DNA dizi tekrarlarının arasında ise aralayıcı (spacer) adı verilen DNA bölgeleri bulunur.

Özgün DNA dizilerinden oluşan aralayıcı bölgeler, kazanılmış bağışıklık sisteminin belleğini

oluşturan temel öğelerdir. Bu bölgeler genellikle bir virüsün veya plazmitin nükleik asitlerinden prokaryot genomuna alınır. Prokaryot bir organizma aynı virüs ile tekrar karşılaştığında ise aralayıcı diziler tanıma bölgesi olarak çalışır ve istilacı genomu parçalamak üzere harekete geçilmesini sağlar.

Tekrar dizilerinin uzunlukları 21-48 baz çift arasında değişirken, aralayıcı bölgeler 26-72 baz çift aralığındadır.

Bir genomda bulunan CRISPR lokusu ise tek veya daha fazla sayıda olabilmektedir.

CRISPR lokusun yukarı akış bölgesinde bulunan ve “lider dizi” adı verilen korunmuş sağlamaktadır.

CRISPR sisteminin diğer önemli bileşeni Cas gen bölgeleridir. Prokaryot bağışıklık sistemi için fonksiyonları çok önemli olan Cas genleri genellikle CRISPR sisteminin yakınında

bulunurlar. Cas proteinlerinin helikaz ve nükleaz özelliklerinin bulunması DNA dizilerini açma ve kesmesine imkân sağlamaktadır. Bu sayede Cas proteinleri nükleik asitlerle etkileşim kurarak nükleaz, helikaz veya RNA bağlanma proteini şeklinde aktivite gösterebilirler.

(Tip I, Tip II ve Tip III CRISPR-Cas sistemlerinin alt grupları ve bileşenleri. Ortolog genler renk koduyla gösterilmiştir. CRISPR-Cas tipini belirleyici olan genler yeşil kutucuk içerisinde, bu genlerin alt tipleri ise kırmızı kutucuk içerisinde belirtilmiştir. Genlerin üzerindeki harfler Cas proteinlerinin başlıca kategorilerini göstermektedir.)

CRISPR Cas-9 Sistemi İle Genom Düzenlenmesi

Endonükleaz: CRISPR sisteminde ihtiyaç duyulan tek protein sadece Cas9 endonükleazı (ya da bir varyantı)’ dır. Bu tek protein;

• Rehber RNA’ya bağlanmak,
• Rehber RNA varlığında, PAM dizisinin 5’ ucuna olmak kaidesi ile hedef DNA’ya bağlanmak,
• Çift zincir kırılması (DSB) sonucunda hedef DNA’yı genomdan ayırmak için gerekli tüm elemanlara sahiptir.

 

 

Rehber RNA’ya Bağlanmak

Rehber RNA, Cas9’un, olası birçok lokus içerisinden spesifik bir genomik yeri kesmesini sağlar.

Rehber RNA Varlığında, PAM Dizisinin 5’ Ucuna Olmak Kaidesi ile Hedef DNA’ya Bağlanmak

Cas9 endonükleazının hedef genomik lokusa bağlanmasına, hem hedef diziyi içeren rehber RNA (gRNA) hem de hedef sekansın bitişiğindeki DNA motifi (PAM) olarak bilinen 3 bazlı bir dizi aracılık eder. Çift zincirli DNA’nın Cas9 tarafından kesilmesi için, rehber RNA ile hedeflenen dizinin hemen 3’ ucunun PAM sekansını içermesi gerekir. Hem PAM dizisi hem de rehber RNA (gRNA) olmadığında, Cas9 hedef diziye bağlanamayacak ve de kesemeyecektir.

Farklı organizmalardan elde edilen Cas9 enziminin homologları ya da çeşitli lablarda geliştirilen mutant Cas9’lar farklı PAM dizilerine sahiptir. Farklı PAM dizileri, araştırmacıların farklı genomik lokusları hedefleyebilmesini sağlar. 3- Çift Zincir Kırılması  Sonucunda Hedef DNA’yı Genomdan Ayırmak Cas9 ve varyantlarının 2 endonükleaz domaini vardır: N ucu RuvC benzeri nükleaz domaini ve protein merkezine yakın HNH benzeri nükleaz domaini. Cas9’un hedefe bağlanması ile hedeflenen DNA zincirinin karşılıklı kesebilmesi için bu 2 nükleaz domaininin gerekli pozisyona getirilmesi gerekir. Bu yüzden, Cas9 konfirmasyonel değişikliğe uğrar. Böylece, Cas9 aracılığı ile oluşan DNA hasarının nihai sonucunda, hedef DNA üzerindeki PAM dizisinin yaklaşık 3-4 baz yukarısında çift zincir kırığı oluşur.

CRISPR Tekniğinin Etiklik Tartışmaları

• CRISPR sisteminin klinik olarak insan ve embriyolarda kullanılıyor olması bu tekniğin ilerleyen zamanlarda canlıya ve diğer kuşaklara olan etkisinin hala tam olarak bilinmemesinden ve daha bşrçok sebepten dolayı bilim dünyasında birçok etik tartışmaya neden olmuştur.

CRISPR Tekniği Neden Etik?

• Bazı bilim insanları insan üzerindeki genetik değişikliklerin başta genetik hastalıkları yok etmek olmak üzere çok parlak bir geleceği olduğunu düşünmektedir. Kistik fibroz, orak hücre anemisi, Huntington hastalığı gibi kalıtsal hastalıkları tamamen ortadan kaldırabilir. Hem de tek bir neslin değil, ailenin tüm genetik hattının bu hastalıklardan arınabilecekleri düşünülmektedir.
• Araştırmacılar bu sayede hastalıklara etkili çözümler geliştirebileceğini, dayanıklı bitkilerin yetiştirilebileceğini ve hastalık nedeni olabilecek patojenler ile etkili mücadele edileceğini düşünmektedirler.
• Aşırı avlanma sonucu soyu tükenmiş olan hayvanların yeniden Dünya’da boy göstermelerine olanak sağlaması. Örneğin Kaliforniya Üniversitesi’nden Ben Novak bir zamanlar sayıca çok bol olarak bulunan ve ne yazık ki aşırı avlanma sonucu 10 yüzyılın sonralarında soyu tükenen posta güvercinlerini ( Ectopistes migratorius ) bu yöntemle yeniden yaşama döndürmeye çalışılmaktadır.
• Harvard Tıp Fakültesi’nde kök hücre üzerine çalışmalar yapan George Daley, sadece bilimsel sonuçlara ulaşmak için bu tarz çalışmalar yapılabileceğini savunmaktadır.
• Wilson, CRISPR’ın eninde sonunda tedavi ve terapi alanında yaygın kullanılacağını, bu bakımdan son yıllarda ki en harika gelişme olduğunu belirtmektedir.
• Tarım alanında da devrim yaratacak; çeşitli, besin değeri yüksek ve ucuz maliyette üretimlerin yapılması,
• Embriyo üzerinde yapılan çalışmalarla ilerleyen yıllarda tamamen sağlıklı ve istenilen fenotiplerde insanların oluşturulabileceği bilim insanları tarafından düşünülmektedir.

CRISPR Tekniği Neden Etik Değil?

• Mart ayında Nature dergisinde yayımlanan bir makalede bilim insanları, embriyolara yapılan genetik müdahalelerin kalıtılabilir olduğundan ve öngörülemez sonuçlara yol açabileceğinden bahsetmiştir. Ayrıca bu gibi uygulamaların yaygınlaşmasının, etik olmayan deneylerde de kullanımın önünü açabileceğinden söz etmektedir. Bazı bilim insanları ise, bu çalışmanın etik sınırı çoktan aştığını düşünmektedir. Makalenin yazarlarından biri olan, Sangamo Biosciences’in Genel Müdürü Edward Lanphier konuyla ilgili olarak ‘’ geçtiğimiz aylarda söylediğimiz şeylerin önemi ortaya çıkmış oldu. Bu çalışmayı durdurmalı ve oturup ne yöne gittiğimizi tartışmalıyız ‘’ diyor.
• Harvard Tıp Fakültesi’nde kök hücre üzerine çalışmalar yapan George Daley, sadece bilimsel sonuçlara ulaşmak için bu tarz çalışmalar yapılabileceğini savunuyor. Bu çalışmanın, klinik uygulamalarla alakası olmayan sorulara cevap verilebileceğini söylemektedir.
• CRISPR uygulamaları genetik materyalin hedefli yere yönlendirilmesi başarılmış ancak çeşitli mutasyonların da bunun yanında gerçekleştiği saptanmıştır. Huang bu sebeple kolay uygulanan CRISPR/CAS9 tekniği yerine, daha az mutasyona sebep olan TALEN tekniğinin kullanabileceğini belirtmektedir.

 

 

Şevval ÇAKIR

 

 

Kaynaklar;

1. neb.com/tools-and-resources/feature-articles/crispr-cas9-and-targeted-genome-editing-a-new-era-in-molecular-biology

2. fizikist.com/crispr-cas9-ve-gen-muhendisligi/

3. academia.edu/23736409/CRISPR_Cas9_Teknolojisi

4. ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3972032/

5. broadinstitute.org/what-broad/areas-focus/project-spotlight/questions-and-answers-about-crispr

6. Bozok, V, Kotmakçı, M, Tezcanlı, B, (2017), From The İmmune Response to The —Genome Desıng; Crıspr-cas9 System, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmasötik Biyoteknoloji AD, 37(1):27-42

7. Cihan Taştan,(2018), T101 Crispr Genom Modifikasyonları, s.256, 32:34