MLPA Analizi ve Örnek Bir Protokol
MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)
Türkçe kelime karşılığına baktığımızda “Çoklu Ligasyona Bağlı Prob Amplifikasyonu” anlamına gelen MLPA ilk kez 2000’li yılların başında kullanılmıştır.
Genomik DNA ve RNA dizisindeki artmış ya da azalmış kopya sayısını tespit etmekte kullanılan Multiplex PCR yöntemidir. Bu yöntem ile PCR, FISH gibi diğer yöntemlerden daha hassas olarak kopya sayısındaki artışları ve azalışları tespit etmek mümkündür.
Yöntemin mantığını anlatacak olursak; İlk olarak DNA’lar denatüre edilir. MLPA probe karışımı ile bir gece inkübe edilir. Probelar DNA ile hibridize olur ve PCR aşaması ile hibridize olan bölgeler çoğalır. Kapiller elektroforez cihazı ile bu çoğalan bölgeler ayrıştırılarak kopya sayılarına göre delesyon duplikasyon analizi yapılmış olur.
GEREKLİ CİHAZLAR:
Termal Cycle Cihazı
Kapiller Elektroforez
ANALİZ GÖRÜNTÜSÜ:
MLPA ÇALIŞMASI ÇALIŞMA PROTOKOLÜ
1- ÇALIŞMA ÖNCESİ DİKKAT EDİLECEKLER:
1.1. MLPA için tüm hasta ve referans DNA’ları 10 ng/µl olacak şekilde TE Buffer ile ayarlanır.
1.2. 260/280 oranı ise 1.8 ile 1.9 olmalıdır.
1.3. Hasta sayısı dikkate alınmadan her çalışmada 4 referans olmalıdır.
Not: Bayan hasta için bayan referans erkek hasta içinde erkek referans olmalıdır.
2- DNA DENATÜRASYONU VE HİBRİZASYONU:
2.1. PCR cihazı ayarlanır.
| 98 ˚C
5 dk. |
25 ˚C
10 dk. |
95 ˚C
1 dk. |
60 ˚C
17 sa. |
2.2. DNA’lar PCR cihazında 98 ˚C’de 5 dk. bekletilir.
2.3. PcCR cihazı 25 ˚C’de 10 dk. bekleme sırasında ProbeMix hazırlanır. (+1 örnek saysı miktarı ile)
2.4. ProbMix Hazırlanışı:
X1 Çözeltisi aşağıdaki gibi hazırlanır.
1.5 µl Salsa ProbeMix ve 1.5 µl MLPA Buffer olmak üzere toplam 3 mikrolitre hazırlanır.
2.5. PCR cihazı 25 ˚C’ye ulaşınca her tüp için hazırlanan karışımdan 3 µl PCR cihazından tüpler çıkarılmadan DNA tüplerine eklenir. Sonra spin ve vorteks yapılarak PCR’a devam edilir.
2.6. 95 ˚C’de 1 dk. inkübe edilir ve ardından 60 ˚C’de 16-20 saat aralığında inkübe edilir.
3- LİGASYON VE DİJESYON:
17 saat sonunda aşağıda hazırlanan Ligase-65 Mix her örneğe eklenir. (+1 örnek saysı miktarı ile)
|
Ligase-65 mix Malzemeleri |
Miktar (µl) |
|
Ligase-65 Buffer A |
3 µl |
| Ligase-65 Buffer B |
3 µl |
|
Su |
25 µl |
|
Ligase-65 Enzim |
1 µl |
| Toplam |
32 µl |
3.1. PCR cihazı ayarlanır.
| 54 ˚C
15 dk. |
98 ˚C
5 dk. |
20 ˚C
∞ |
3.2. PCR cihazı 54 ˚C’de iken 32 µl litre Ligase-65 mix her örneğe konur ve spin vorteks edilir.
3.3. 54 ˚C’de 15 dk. inkübe edilir ve 98 ˚C’de 5 dk. bekletilir.
3.4. Ligasyon ürünleri 1 hafta 4 ˚C’de saklanabilir.
4- PCR REAKSİYONU:
Salsa PCR Mix hazırlanır.
Dikkat edilecek nokta : Tüm polimerazlarda olduğu gibi Salsa Polimeraz da kullanacağımız zaman çıkartıp kullandıktan sonra -20 ˚C’ye kaldırmak gerekir. (Kısa sürede +4 ˚C’de bekletilebilir.)
SALSA PCR-PRİMER MİX
|
SALSA PCR-PRİMER MİX |
2 µl |
|
SU |
7.5 µl |
|
SALSA POLYMERAZ |
0.5 µl |
| TOPLAM |
10 µl |
Not: Ürünler vortekslemeden pipetaj yapılarak buz üzerinde hazırlanır. (+1 örnek saysı miktarı ile)
4.1. Hazırlanan mix oda sıcaklığında bulunan DNA ligasyon ürünlerinin üzerine 10 µl konur.
4.2. Spin vorteks yapılır.
| 95 ˚C
30 sn. |
60 ˚C
30 sn. |
72 ˚C
1 dk. |
72 ˚C
20 dk |
15 ˚C
∞ |
4.3. PCR ürünleri 1 hafta 4 derece de yada -20 de karanlıkta daha uzun saklanabilir.
5- LİZ & FORMAMİD AŞAMASI:
| LİZ | 0.3 µl |
| FORMAMİD | 8.7 µl |
5.1. Yukarıdaki karışım hazırlanır. (+1 örnek saysı miktarı ile)
5.2. 96 plakaya kuyucuk başına 9 µl konur.
5.3. 96 plaka yüklenirken hem referans için hem de PCR ürünleri için 2 kez yüklenir.
5.4. Üzerine sırası ile PCR ürünlerinden 1 µl konur. 96 plaka yüklenirken hem referans hem de PCR ürünleri 2 kez yüklenir.
5.5. PCR cihazında 95 derecede 2 dak. denatüre edilir.
5.6. Spin Vorteks yapılır.
5.7. Sekans cihazına yükleme yapılır.
Yazar: Ömer Cihangir TAŞKAN
Tarih: 24 Eylül 2018
Linkedin Profili : https://www.linkedin.com/in/cihangirtaskan/
