Mikrobiyoloji Laboratuvarlarında Aseptik Teknikler

Hücre, doku ve organ kültürlerinde mikroorganizmaların girişini önlemede kullanılan işlemlerlere aseptik teknik denir. Çalışılan örneklere mikroorganizma enfeksiyonunun ve bulaşmanın (kontaminasyon) önlenmesi, sterilitenin korunması için steril ekipman ve besiyerlerine uygulanan koruyucu işlemlerdir.

Aseptik teknik; kültürlerin, steril ortam stoklarının ve diğer solüsyonların istenmeyen mikroorganizmalar (yani sepsis) tarafından kontamine olmasını önlemek için alınan bir dizi rutin önlemdir.

Bu tür eylemler bazen “steril teknik” olarak adlandırılsa da, bu terminoloji yalnızca herhangi bir organizmanın laboratuvara veya tıbbi ekipmana ve reaktiflere (örneğin ameliyat sırasında) girmesini önlemek için uygundur.

Laboratuvar ortamında yabancı organizmaların kontaminasyonunu önleyerek mikroorganizmaları veya ökaryotik hücreleri büyütmek için aseptik teknikler çok önemlidir.

Tamamen steril bir çalışma ortamının mümkün olmadığı unutulmamalıdır. Bununla birlikte, kültür kontaminasyonu riskini azaltacak bir dizi basit, sağduyulu prosedür vardır. Aseptik teknikler, kültürlerin çevreden mikroorganizmalar tarafından kontaminasyonu veya işlenen mikroorganizmalar tarafından çevrenin kontaminasyonu kontrol altında tutar.

Yaygın aseptik teknik örnekleri şunlardır:

• Kullanımdan önce laboratuvar yüzeylerinin temizlenmesi ve dezenfekte edilmesi
• Kültürlerin veya besiyerinin kapatılma ve havaya maruz kalma süresinin sınırlandırılması
• Petri kaplarını mümkün olduğunca kapalı tutmak
• Kültürler veya ortam ile temas eden aşılama döngülerini ve diğer ekipmanı etkin bir şekilde sterilize etmek ve kültürler veya steril aletler üzerinde nefes almaktan kaçınmak.

Herhangi bir aseptik teknik için uyulması gereken bazı genel kurallar vardır.

• Hava akımını azaltmak ve havayı bozabilecek ani hareketleri önlemek için pencereleri ve kapıları kapatın. Laboratuvarda açılan pencere bulunmaması aseptik kuşulları sağlamaya katkı sunar.
• Dezenfekte edilmiş bir yüzey üzerinde transferler yapın.
• Hızlı etkisi nedeniyle etanol dezenfeksiyonu önerilir. Tezgah yüzeyinin temizlenmesi zorsa, tezgahı daha kolay dezenfekte edilebilen sert bir malzeme ile örtün.
• İşlemleri yalnızca tüm aparat ve malzemeler kolay ulaşılabilecek bir yerdeyken başlatın.
• Tüm işlemleri olabildiğince çabuk ama acele etmeden tamamlayın.
• Kaplar mümkün olan en kısa süre boyunca açık olmalıdır.
• Kaplar açıkken, tüm işler hava akımlarının yukarı doğru çekildiği bir Bunzen Beki alevine yakın yapılmalıdır.
• Bir test tüpünü veya şişeyi açarken, kap mümkün olduğunca yataya yakın tutularak ve havanın herhangi bir hareketi kaptan dışarı doğru olacak şekilde boyun alevle (aşağıya bakınız) derhal ısıtılmalıdır.
• Petri kabı içeren manipülasyonlar sırasında, steril iç yüzeylerin hava kirliliğine maruz kalmasını sınırlayın.
• Steril pipetlerin kültürlere veya steril kaplara konulacak kısımlarına giysi, çalışma alanı yüzeyi veya şişe/test tüplerinin dışı gibi steril olmayan diğer yüzeylere dokunulmamalı veya temas ettirilmemelidir.
• Mikroorganizmalarla temas eden tüm maddeler, bu tür maruziyetlerden önce ve sonra sterilize edilmelidir. Bu, teknik ekip tarafından bir parça pratik çalışmadan sonra (örneğin, kullanılacak cam eşya olması durumunda) hazırlanan ve temizlenen teknik ekip tarafından veya uygulama sırasında çalışan tarafından (örneğin, bir tel halkayı alevlendirirken).

Spesifik Aseptik Teknikler

Steril Kullanım;

• Ellerinizi ve çalışma alanınızı daima %70 etanol ile silin.
• Eldiven giyilmesi tavsiye edilir. Bu, test sırasında herhangi bir yabancı kirleticinin çalışan ve numune ile temas etmesini önleyecektir. Eldiven kullanılmıyorsa testten önce ve sonra ellerin yıkanması gerekir.
• Hücre kültürü kabine yerleştirmeden önce kapların, şişelerin, balon jojelerin ve kapların dışını %70 etanol ile silin.
• Medya ve reaktifleri doğrudan şişelerden dökmekten kaçının.
• Sıvılarla çalışmak için steril cam veya tek kullanımlık plastik pipetler ve bir pipetör kullanın ve çapraz kontaminasyonu önlemek için her pipeti yalnızca bir kez kullanın.
• Kullanılıncaya kadar steril pipetleri açmayın.
• Pipetleri çalışma alanında tutun.
• Kullanımdan sonra şişeleri ve kapları daima kapatın ve mikroorganizmaların ve havadaki kirleticilerin girmesini önlemek için çok kuyulu plakaları bantla kapatın veya yeniden kullanılabilir torbalara koyun.
• Kullanmaya hazır olduğunuz ana kadar asla steril bir şişe, kavanoz, petri kabı vb. Açmayın ve asla ortama açık bırakmayın. İşiniz biter bitmez kapağını kapatın. Bir kapağı açarsanız ve çalışma yüzeyine koymanız gerekiyorsa, kapağı yüzeye sırtı gelecek şekilde yerleştirin.
• Yalnızca steril cam eşyalar ve diğer ekipmanları kullanın.
• Steril prosedürleri gerçekleştirirken konuşmamaya, şarkı söylememeye veya ıslık çalmamaya dikkat edin.
• Kontaminasyonu en aza indirmek için deneyleri olabildiğince hızlı gerçekleştirin.

Agar plakalarının, slope ve kültürlerin ekilmesi;

• Kültürlerin transferini mümkün olduğunca çabuk, tüpler ve plakalar minimum süre boyunca havaya açık olarak gerçekleştirin.
• Normal uygulama, agar plakalarını kabinin ön yüzeyinden uzakta ve kapağı tabandan tamamen çıkarmadan açmaktır.
• Petri kabının kapağının normalden daha uzun süre açık tutulması gereken durumlarda, kontaminasyon olasılığını azaltmak için Bunzen Bek alevine çok yakın çalışın.
• Plakalarda mantar sporları ile sık sık kontaminasyon yaşıyorsanız, cereyan olasılığını daha da azaltın ve plakaları agar yüzeyi aşağı bakacak şekilde aşağıdan ekim yapmayı düşünün. Bu şekilde, sporların havadan plakaya yerleşme olasılığı daha az olabilir.

Bir tel döngü kullanma (aşılama döngüsü);

• Bir tel halka kullanırken, neredeyse dikey bir açıyla bir kalem tutar gibi, tel halkanın tutamağını üste yakın tutun. Bu, küçük parmağın şişenin/test tüpünün vidalı kapağını/pamuk tapasını tutmasını sağlar. Ayrıca, döngüdeki herhangi bir sıvı kültürün aleve akmasını sağlar.
• Kullanımdan önce ve sonra kuvvetli mavi bunzen bek alevinde kırmızı sıcaklığa (kızarana) kadar ısıtarak tel halkayı sterilize edin. Bu, kirletici bakteri sporlarının yok edilmesini sağlar.
• Alev alma prosedürü, döngünün ucunu kademeli olarak ısıtmalıdır. Bunun nedeni, kullanımdan sonra hızlı ısıtmada sıçrayan ve muhtemelen küçük kültür parçacıkları salarak bir aerosol oluşturan kültür içereceğidir.
• Telin sap ucunu alevin açık mavi konisine yerleştirin. Burası alevin en soğuk bölgesidir. Telin geri kalanını yavaşça alevin en sıcak bölgesine doğru çekin – mavi koninin hemen üstüne. Kırmızı kızarana kadar kadar orada tutun.
• Telin tam uzunluğunun yeterli ısıtma aldığından emin olun.
• Havada birkaç saniye soğumaya bırakın, ardından hemen kullanın.
• Döngüyü yere koymayın veya sallamayın.
• Kullanımdan hemen sonra döngüyü yeniden sterilize edin.

Pipet Kullanımı;

• Kültürleri, steril ortamları ve steril solüsyonları aktarmak için steril dereceli veya damlalıklı (Pasteur) pipetler kullanılır.
• Pipeti, yeterli sıkma gücüyle olabildiğince az dokunmaya dikkat ederek, pamuklu tıpa içeren uç kısmından tutarak kabından/ambalajından çıkarın.
• Emziği takın. Bazen meme ucunu yağlamak için önce steril sıvıya batırmak faydalı olabilir.
• Pipet ucunu bir kalem tutar gibi tutun, ancak meme ucunu tutmayın. Bu, küçük parmağınızı bir şişenin/test tüpünün kapağını/pamuk tapasını tutmakta ve başparmağınızı da emziği kontrol etmekte serbest bırakır.
• Emziği dikkatli bir şekilde bastırın ve gereken miktar için yeterli miktarda sıvı alın, ancak pamuk tıkacına ulaşıp ıslatmayın. Meme ucunu pipet ucuyla sıvı yüzeyinin altına sıkmak, ‘tükürmeye’ ve sonuç olarak aerosol oluşumuna neden olabilecek hava kabarcıkları oluşturur.
• Ucu sıvıya yerleştirmeden önce emziği sıkarak bundan kaçının. Ardından, gerekli miktarda sıvı çekilene kadar basıncı yavaşça bırakın ve pipet ucunu sıvıdan kaldırarak çıkarın. Fazlalığı nazikçe boşaltın.
• Kullanımdan hemen sonra kontamine pipeti yakındaki bir dezenfektan kabına koyun.
• Memeyi yalnızca pipet atılan kabın içindeyken çıkarın, aksi takdirde kültür damlaları çalışma yüzeyini kontamine eder.

Şişelerin ve test tüplerinin boynunu yakmak;

Bu, kültürü veya ortamı kontamine edecek mikroorganizmanın hiçbirinin kabın ağzına girmesini engeller. Şişenin ağzını bir alevden geçirmek, açıklıktan uzakta bir konveksiyon akımı üretir ve kontaminasyonun önlenmesine yardımcı olur. Alevin sıcak kısmı içteki parlak mavi ‘koninin’ üzerindedir ve kabın yerinde tutulmadan alevin içinden hareket ettirilmesi gerekir.

• Şişenin kapağını kolayca çıkarılabilmesi için gevşetin.
• Şişeyi/test tüpünü sol elinizle kaldırın.
• Şişenin/test tüpünün kapağını/pamuk tapasını, serçe parmağınız sağ elinizin avuç içine doğru kıvrılmış şekilde çıkarın. (Kapağı değil, şişeyi çevirin.)
• Kep/pamuk tapasını yere koymayın.
• Şişenin/test tüpünün boynunu, sıcak bir bunzen beki alevinden ileri ve geri geçirerek alevlendirin.
• Gerekli prosedürü gerçekleştirdikten sonra, örneğin kültürü geri çekme gibi, küçük parmağınızı kullanarak şişe/test tüpü üzerindeki kapağı/pamuk tapayı yerine takın. Bu aşamada dikkatli olun !!! Şişe sıcak olacak. (Kapağı değil, şişeyi çevirin.)
• Pamuk yünü tıkaçlar şekillerini kısmen kaybetmişse, tıpa aşağı itilirken kabın ağzını yavaşça bükerek kabın boynuna daha kolay yönlendirilebilirler.

Yüzeyleri dezenfekte etme;

• Çalışanlar için, hızlı etkisi nedeniyle (yaklaşık 5 dakika) etanol dezenfeksiyonu önerilir. Ancak etanol ile çalışırken olası tehlikeler ve güvenlik önlemleri konusunda bilgi sahibi olunmalıdır.

Aseptik Koşulların Korunması İçin Kullanılan Araçlar

Bunzen Brülörü (Bunzen Beki);

• Laboratuvar tezgahında nispeten steril bir ortam yaratmanın muhtemelen en kolay yolu, basit bir gazla çalışan brülör kullanmaktır.
• Bu yaygın ekipman parçası, neredeyse 150 yıl önce Alman kimyager Robert Wilhelm Bunsen (1811-1899) tarafından yapılan bir tasarıma dayalı olarak, genellikle doğal gaz (metan) olmak üzere sürekli bir yanıcı gaz akışını yakar.
• Aseptik teknikte açık alevin ana amacı, organizmaların asılı toz parçacıkları üzerindeki canlılığını azaltmak için laboratuvar tezgahının üzerinde ve çevresinde bir sıcak hava konisi oluşturmaktır.
• Bunsen brülör alevinin nesneleri çok hızlı bir şekilde ısıtma özelliği, onu aşılama halkalarını sterilize etmek, cam şişe boyunlarını ısıtmak veya kültür yayıcılarda alkolü tutuşturmak için ideal bir seçim haline getirir.
• Bir Bunsen brülörü bazı durumlarda, örneğin ısının hava akışını bozacağı laminer akış ünitesinde pratik değildir. Alternatif olarak bir mikro yakma fırını kullanılabilir. Bu dairesel bir ısıtma elemanından oluşur. Halkanın içine aşılama halkası veya iğne yerleştirmek, halkayı/iğneyi hızla ısıtacak ve sterilize edecektir. Bir mikro yakıcının, yanan bir Bunsen brülörünün diğer aseptik teknik faydalarını sağlamadığını unutmayın.

Bunzen Brülörü etki alanı merkezde yanan ateşten 10 cm sağ ve sol ve 10 cm yukarıyı kapsayacak şekildedir. Bu nedenle uygulama alnı iyi belirlenmeli ve numuneler doğru konumlandırılmalıdır.

Biyogüvenlik Kabinleri;

• Biyogüvenlik kabini, reaktiflerin ve biyolojik kültürlerin kontaminasyonunu önlemeye daha fazla yardımcı olabilecek gelişmiş bir cihazdır.
• Doğru kullanıldığında, çalışma alanına temiz, ultra filtrelenmiş hava sağlar. Ayrıca oda havasının çalışma alanına girmesini önler ve personel tarafından çalışma alanına getirilen havadaki kirletici maddeleri hem askıya alır hem de uzaklaştırır.
• Bir biyogüvenlik kabinini en önemli parçası, yüksek verimli bakteri tutucu filtre, yani HEPA (yüksek verimli partikül hava) filtresidir.
• Sertifikalı bir HEPA filtresi, 85 litre/dk’da >0,3 μm boyutundaki toz, polen, küf, bakteri ve havadaki partiküllerin minimum %99,97’sini yakalamalıdır.
• İlk HEPA filtreleri 1940’larda ABD Atom Enerjisi Komisyonu tarafından Manhattan Projesi’nin (atom bombasının geliştirilmesi) bir parçası olarak radyoaktif partikül kirleticileri filtrelemek için verimli ve etkili bir yol sağlamak için geliştirildi. HEPA filtre teknolojisi, II. Dünya Savaşı’ndan sonra sınıflandırıldı ve kapsamlı araştırma ve ticari kullanıma izin verdi.
• Biyogüvenlik kabinleri, virüslerin ve bazı bakterilerin yayılmasını önlemeye yardımcı oldukları birçok biyogüvenlik düzeyi (BSL)-2 laboratuvarının temel bileşenleridir.

Çeviri Kaynağı: https://microbenotes.com/general-aseptic-techniques-in-microbiology-laboratory/