SDS-Page (Poliakrilamid Jel Elektroforezi)

Elektroforez bir elektrik alanda yüklü moleküllerin ayrılması için kullanılan bir yöntemdir. Jel elektroforezi ise porlu bir destek ortam kullanılarak, moleküllerin yük, büyüklük ve konformasyon farklarına göre ayrılması tekniğine dayanmaktadır.

Jel elektroforezi kullanılan destek ortamın türüne göre iki başlıkta toplanabilmektedir.

1-Agaroz Jel Elektroforezi

2-Poliakrilamid Jel Elektroforezi

Agaroz jelin ayırma gücü poliakrilamid jele göre daha düşüktür. Agaroz Jel Elektroforezi yatay bir sistem üzerinde gerçekleştirilirken poliakrilamid jelde dikey bir jel düzeneği kullanılmaktadır. Agaroz Jeller soğuyarak jel haline gelirken poliakrilamid Jeller polimerleşme reaksiyonu ile meydana gelmektedir.

Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE); SDS poliakrilamid jel elektroforezi proteinlerin analizi açısından çok güçlü bir yöntemdir. Prensip olarak suda çözülmeyenler de dahil olmak üzere, bütün proteinlerin ayrımı için kullanılabilmektedir.

Zar proteinleri, hücre iskeletinin protein bileşenleri ve daha büyük hücresel topakların bileşenlerini oluşturan proteinlerin hepsi bu yöntemle ayrılabilmektedir.  Proteinler moleküler ağırlığına dayalı olarak bir poliakrilamid jeli içinde ayrılır.

Proteinler amfoterik molekküllerdir, yani hem pozitif hem de negatif yüklere sahiptirler. Proteinleri tek yönlü hareket ettirebilmek için, üzerlerine düzgün bir şekilde negatif yük yaratılır. Proteinler SDS ile karıştırıldığı zaman net bir negatif yük alırlar. SDS proteinleri denatüre eder ve denatürasyon sonrasında bütün proteinler benzer yapı gösterir. Ayrıca anyonik bir deterjan molekülüne bağlanma sonucu, bütün proteinler homojen bir biçimde dağıtılmış negatif yüke sahiptir.

SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) sistemlerinde kesintili bir jel sistemi kullanılır. Örnekler öncelikle yükleme jeli boyunca dar bir alanda konsantre edilir. Yükleme jelinin konsantrasyonu ve pH’ı daha düşüktür. Düşük konsantrasyon sayesinde porlar daha büyük, moleküler eleme etkisi daha düşüktür. Örnekler yürütme jeline girdikten sonra ise büyüklüklerine göre ayrılırlar. Yürütme jelinin konsantrasyonu ve pH’ı daha yüksektir.

Jel Hazırlanmasında Kullanılan Kimyasallar;

Akrilamid; Jel polimerinin monomeridir. Serbest radikal polimerizasyonu ile polimerize olur.

N,N’-metilen-bis (Akrilamid); Çapraz bağlayıcı ajandır. Jelleşmeyi sağlar.

SDS (Sodyum Dodesil Sülfat); Proteinleri denatüre eder ve üç boyutlu yapılarını bozarak proteinleri doğrusal hale getirir.

Tetrametilendiamin (TEMED); Serbest radikalleri kararlı hale getirir.

Amonyum Persülfat (APS); Serbest radikallerin kaynağıdır ve jel oluşumunu başlatır.

Gliserol; Örneklere yoğunluk vermek için kullanılanılır.

ß-Merkaptoetanol; Denatürasyona yardımcı olur ve disülfit bağlarını kırar.

Tris

Brom fenol mavisi

TCA (Trikloroasetik asit)

Coomassie

Glasiyel asetik asit

SDS-PAGE için kullanılan kimyasalların yüzdesi ve miktarları farklıdır. Bu kimyasalların miktarları ve hazırlanışlarına bilimsel yayınlardan ulaşılabilmektedir.

Yürütme ve Yükleme Jellerinin Hazırlanması;

Yükleme ee Elektroforez İşlemi

• Öncelikle dikey elektroforez sistemi hazırlanır. Jelin döküleceği camlar temizlenir ve düzenek kurulur.
• İlk olarak yürütme jeli olmak üzere jeller hazırlanır.
• Yürütme jeli için kullanılacak maddelerden APS ve TEMED hariç diğer maddeler belirlenen miktarlarda temiz bir behere koyulur.
• Koyulan maddeler iyice karıştırıldıktan sonra APS ve TEMED eklenir.
• Elde edilmiş olan karışım hızlı bir şekilde camlar arasına mikropipet yardımı ile dökülür. Hava kabarcığı oluşmamasına özen gösterilir.
• Jel dökümü bittikten sonra, distile su yürütme jelinin üzerine dökülerek jelin hava almaması sağlanır.
• Jelin polimerleşmesi için yaklaşık olarak 30-40 dk kadar beklenir.
• Yürütme jeli hazır olduktan sonra aynı işlemler yükleme jeli için de gerçekleştirilir.
• Yürütme jeli yüklendikten sonra camların ara kalınlığına uygun olarak taraklar yerleştirilir.
• Yükleme jeli donduktan sonra taraklar yavaşça çıkarılır ve jel elektroforez aparatına yerleştirilir.
• Jel tankına elektroforez tamponu ilave edilir.
• İstenilen miktarda protein örneği, belli miktar yükleme tamponu ile karıştırılarak 3 dakika kadar kaynatılır.
• Kaynayan örnekler dikkatli bir şekilde kuyucuklara yüklenir.
• Yükleme bittiğinde jel tankının kapağı kapatılarak güç kaynağının bağlantıları yapılır.
• Örnekler yükleme jeli boyunca 80V’da, yürütme jeline geçildiğinde ise 120V’da yürütülür.
• Yürütme bittiğinde jel önce boyama çözeltisine alınır ve belli bir süre de inkübe edilir.
• Boyama çözeltisinden alınan jel arındırma çözeltisinde bir süre inkübe edilir.
• İnkübasyon boyunca arındırma çözeltisi sürekli yenilenir.
• Jel boyadan arındığında ise arındırma çözeltisinden çıkarılır ve görüntüleme cihazında beyaz ışık altında bantlar gözlemlenir.

 

Şevval ÇAKIR

 

Kaynaklar;

1-sciencedirect.com/topics/neuroscience/polyacrylamide-gel-electrophoresi

2-slidegur.com/doc/1221084/jel-elektroforezi%CC%87-sds-page

3-Cooper, G.M., Hausman, R.E., The cell: A Molecular Approach, Third Edition, ASM Press, 2004.

4-Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff , M., Roberts, K., Walter, P., Molecular Biology of the Cell, Fourth Edition, Garland Science, 2002.

5-slideplayer.biz.tr/slide/2302640/