Sıvı Kromatografi Sisteminde Önemli Parametreler

1- Alıkonma zamanı (tR):

Maddenin kolon içerisinde kalma süresini ifade eder. Enjeksiyonun kolona verildiği süreden dedektöre ulaşıp çıktığı süreye kadar olan zamanın ifadesidir.

Ayrılacak maddenin kolonla etkileşimini, dolayısı ile alıkonma süresini etkileyen başlıca parametreler;

1- Kolon özellikleri

2- Kolon sıcaklığı

3- Mobil fazın bileşimi

4-Sabit fazın tipi ve özellikleri

5- Sabit faz-hareketli faz-analit arasında olan moleküller arası etkileşimler.

Optimum çalışma şartları tüm bu parametreler dikkate alınarak değerlendirilmelidir.

 

2- Alıkonma/Kapasite Faktörü (k’):

Alıkonma (veya kapasite) faktörü (k’), analitin kromatografik kolon üzerindeki kalıcılığını ölçmek için kullanılan bir parametredir. Kapasite faktörünü; maddenin yapısı, sabit faz ve hareketli fazın türü belirler.

Kapasite Faktörü (k’) : (tR – t0) / t0

to : Hareketli faz pikinin alıkonma zamanı

tR : Analit pikinin alıkonma zamanı

k’ : Kapasite faktörü

Hareketli faz (ölü hacim) pikini (t0) belirlemenin en ideal yolu enjeksiyon yapıldıktan hemen sonra baseline üzerinde görülen ilk kırılmayı almaktır.

Kapasite faktörü akış hızından etkilenmez. Alıkonma süreleri akış hızı değişimi ile değişirken kapasite faktörü sabit kalır. Kapasite faktörü hareketli fazın gücü değiştirerek kontrol edilir. Kapasite faktörürün rezolusyon üzerine büyük etkisi vardır. Düşük çıkış zamanlarında rezolusyon sıfıra yaklaşır.

Kapasite faktörü;

İdeal kapasite faktörü 1<k'<10 aralığında seçilmelidir.

• (k’) küçük olduğu zaman (0-1) rezolusyon sınırlıdır.
• (k’) arttıkça rezolusyonda artar k=2-10 arası olduğu zaman iyi rezolusyon sağlanmaktadır.
• (k’) değeri daha fazla artırmak rezolusyonu değil ayırma süresini arttırır. k’ 20 değerinden fazla olursa rezolusyondaki artış azalır. Büyük k’ değerleri uzun alıkonma zamanları gerektirir.

 

Kapasite Faktörü Nasıl Değiştirilebilir ?

Kapasite faktörü hareketli fazın kompoziyonu ile değiştirilebilir. Hareketli fazın kuvvetli veya zayıf çözücü olması ile k’ faktörü ayarlanabilir. Küçük kapasite faktörü veren hareketli çözücüler kuvvetli çözücülerdir. Kuvvetli çözücü içeren hareketli fazlarda analit sabit fazdan daha çok hareketli faza ilgi duyar. Büyük kapasite faktörü veren hareketli çözücüler zayıf çözücülerdir. Zayıf çözücülerde analit hareketli fazdan daha çok sabit faza ilgi duyar. Hareketli fazlar genellikle zayıf ve kuvvetli çözücü kompozisyonları şeklinde kullanılır. Bu özellikten faydalanılarak kapasite faktörü ayarlanabilir. Bu genellikle ters fazlı kromatografide, mobil faz karışımı içerisinde organik çözücü (değiştirici) miktarını değiştirerek elde edilir.

Karakteristik bir ters faz HPLC sistemi polar olmayan bir sabit faza sahiptir. Dolayısıyla, hareketli fazın polaritesinin arttırılması, analit moleküllerinin hidrofobik (polar olmayan) bölümlerini giderek sabit faza iter ve analit, kolona daha uzun süre tutunur.

Kapasite faktörü düşük akış hızı değişimlerinden, kolon ve tubign çapı gibi bazı kritik parametre değişimlerinden bağımsızdır. Bu nedenle farklı HPLC sistemleri karşılaştırılırken kullanılabilecek yararlı bir parametredir.

3-Etkinlik/Teorik Plaka Sayısı (N):

Etkinlik veya diğer bir ifade ile teorik plaka sayısı farklı kolonların etkinliklerini karşılaştırabilmek için kullanılır. Kolon etkinliği elde edilen pik genişliği ile ilgilidir. Dar pikler elde edilen kolonların etkinlikleri yüksektir ve tam tersi geniş ve yayvan pik veren kolonların etkinlikleri düşüktür. Diğer bir ifade ile teorik plaka sayısı yüksek olan kolonlar daha keskin ve dar pikler verirken düşük teorik plaka sayısına sahip kolonlar geniş ve yayvan pikler verir. Kolon etkinliği yüksek kolonlarda maddeleri ayırmak daha kolaydır. Etkinlik kolon performansını anlayabilmek amacıyla en sık kullanılan parametrelerden biridir.

Etkinlik kolon uzunluğu, partikül boyutu ve akış hızının bir fonksiyonundan oluşur. Bu parametrelerde yapılan bir değişiklik kolon basıncını da değiştirecektir. Ayrıca değiştirilen kolon uzunluğu ve akış hızı alıkonma zamanlarını da değiştirecektir. Etkinlik şu şekilde ifade edilir;

 

Etkinlik/Teorik Plaka Sayısı hesaplamada alternatif olarak şu denklem de kullanılabilir;

 

Aşağıdaki kromatogramda etkinlik için verilen iki formülde yer alan pik genişliği(Wt) ve yarı yükseklikte pik genişliği(W1/2) kavramları gösterilmiştir.

4-Seçicilik/Ayrım Faktörü (α):

Seçicilik iki pikin maksimumu arasındaki zamanın veya mesafenin bir ölçüsüdür. Diğer bir ifadeyle kapasite faktörlerinin oranıdır. Seçicilik faktöründe meydana gelen küçük değişiklikler rezolüsyonda büyük etkilere sahiptir. Seçimlilik hareketli ve sabit faz bileşimi ile değişir. Sıcaklıkta seçiciliği etkileyen bir diğer faktör olabilir.

Eğer α=1 ise iki pikin tutunma süreleri aynıdır ve aynı elüsyona sahiptirler.  Seçicilik/Ayrım Faktörü (α) aşağıdaki formül ile ifade edilir.

5-Rezolusyon (Rs):

Rezolusyon pikler arası ayrımın bir ölçüsüdür ve bir kolonun ilgili pikleri ayırma kapasitesini ifade eder. Böylelikle rezolusyon ne kadar yüksek olursa iki pik arasındaki taban çizgilerinin ayrımı o kadar iyi olur. Rezolusyon, “Etkinlik/Teorik Plaka Sayısı (N)”, “Seçicilik/Ayrım Faktörü (α)” ve “Alıkonma/Kapasite Faktörü (k’)” parametreleri ile ilgilidir. Bu ilişki şu şekilde formülize edilir;

Formülü yorumladığımızda şu sonuçlara varırız;

• Etkinlik faktörü akış hızı, kolon uzunluğu veya dolgu maddelerinin partikül boyutu ile değişir. Etkinlik kontrolü pik genişliği ile ilgilidir. Rezolusyon arttıkça pik genişliği düşer.
• Rezolusyon N’nin kare kökünün bir fonksiyonu olduğu için N’deki büyük artışlar rezolusyonda küçük değişiklikler meydana getirir.
• Etkinlik plaka sayısı N ile ifade edilir. N, çıkış zamanı ve pik genişliği kullanılarak hesaplanır.
• Rezolusyonu en çok Seçicilik/Ayrım Faktörü (α) etkiler. Seçimlilik hareketli ve sabit faz bileşimi ile değişir. Bu rezolusyonu arttırmak için tercih edilen en kolay yoldur.

Daha detaylı olarak aşağıdaki tabloda rezolusyonun bu parametreler ile olan ilişkisi verilmiştir.

5-Basınç:

Bir HPLC sisteminin basınç denklemini şu 5 parametre belirler; solvent viskozitesi (n), akış hızı (F), kolon uzunluğu (L), kolon yarıçapı (r) ve partikül çapı (dp). Denklem şu şekilde ifade edilir;

Sistem basıncını bilmek özellikle metot geliştirme çalışmalarında kolon seçimi yaparken oldukça önemlidir. Bu nedenle bu denklemi iyi bilmek ve her çalışmadan önce kullanmak önemlidir. Formülde görüldüğü üzere partikül çapı (dp) üzerinde yapılacak küçük bir değişiklik bile geri basınç üzerinde önemli bir etkiye sahiptir.

 

6-van Deemter Eğrileri:

Van Deemter denklemi verimliliği, lineer hız (u) veya akış hızının bir fonksiyonu olarak değerlendirir. Van Deemter denklemi “H” ile ifade edilir. H – plaka yüksekliği veya teorik bir plakanın yüksekliği, kolon uzunluğunun (L) hesaplanan teorik plaka sayısına (N) bölünmesiyle belirlenir. Aşağıdaki denklem ile ifade edilir;

Amaç küçük bir plaka yüksekliği elde etmektir.  Bunu daha küçük partikül boyutuna sahip kolonlar, optimum doğrusal hızlar ve düşük viskoziteli mobil faz ile en etkili şekilde yapabiliriz. Parçacık boyutu azaldıkça, optimum doğrusal hız artar. Aşağıdaki eşitlikte bu ilişki ifade edilmiştir.

 

Denklemden görüldüğü üzere plaka yüksekliği ne kadar küçük olursa, plaka sayısı o kadar yüksek olur ve kromatografik çözünürlük artar. Genellikle farklı kolonların performansını değerlendirmek ve bir yöntem için optimum doğrusal hızı (uopt) anlamak için van Deemter eğrilerini çizeriz.

7-Gradient Denklemi:

Numunenizde çok çeşitli bileşenler olduğunda bunları izokritik yöntemle makul bir sürede ayırmanız oldukça zor olacaktır. Bu gibi durumlarda başvurulacak en iyi yöntem gradient ayrımdır. Gradient ayrım, mobil faz kuvvetini zamanın bir fonksiyonu olarak arttırarak, daha hızlı analizler ve daha iyi pik şekli ve kantitasyon ile sonuçlanan bir işlemdir. Gradient ayrım ile daha dar ve dik pik şekilleri elde edilebilir.

Gradient program uygularken dikkat etmeniz gereken bazı değişkenler vardır ve bunları hesaba katmazsanız, kromatografinizle ilgili sorunlara neden olabilir. Aşağıda tanımlanan “Gradient Denklemi“analizinizi etkileyen bu anahtar değişkenleri gösterir.

Denklem alıkonma faktörünün; akış hızı (F), gradient süresi (tG), gradient oranı ve kolon ölü hacmi (Vm) değişkenlerinden nasıl etkilendiğini gösterir. Gradient denkleminde, S bir sabittir ve ayrılan molekülün büyüklüğüne bağlıdır. Küçük moleküller için S’nin değeri yaklaşık 4 ila 6’dır. Peptitler ve proteinler için S, 10 ila 1,000 arasındadır. günümüzde kolon boyunun daha kısa bir kolon boyuna veya daha dar bir iç çapa değiştirilmesi yaygın olarak uygulanır.  Daha yüksek verim veya kütle spektrometresine metot transferi bunun başlıca sebepleri arasındadır. Kolon hacmindeki herhangi bir düşüş, gradient süresinde (tG) veya akış hızında (F) orantılı bir düşüşle dengelenmelidir.

 

Orhan ÇAKAN

 

Kaynaklar;

1-The Theory of HPLC Chromatographic Parameters / Chromacademy

2-Hacettepe Üniversitesi Analitik Kimya Kromatografi Sunumu

3-Agilent The LC Handbook Guide to LC Columns and Method Development