Southern Blot Tekniği

Southern Blot tekniği günümüzde DNA’da bulunan delesyonların saptanmasında, özellikle de DNA finger printing yönteminde başvurulan en önemli tekniktir. Southern blot tekniği ayrıca genetik hastalıklara sahip olan bireylerin ve taşıyıcıların saptanmasında ve adli vakalarda kullanılan bir tekniktir.

Bu yöntemde izole edilen DNA uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilir ve belirli sayı ve uzunlukta DNA frangmentlerinin oluşumu sağlanır. Agaroz jel elektroforez yöntemi ile jel üzerinde büyüklüklerine göre birbirinden ayrılan bu fragmentler önce yüksek pH ile denatüre edilip blot yöntemi ile nitroselüloz filtre üzerine geçirilir.

Southern Blot Tekniği Aşamaları;

1. DNA İzolasyonu;

Üzerinde çalışılacak DNA çeşitli dokulardan izole edilir. En uygun DNA kaynağı ise kan dokusu olarak bilinmektedir. Ancak Farklı dokulardan da izolasyon yapılabilmektedir ( saç, semen, tükürük vb.).

2. DNA’nın Restriksiyon Endonükleaz İle Kesilmesi;

İzole edilen DNA’lar belirlenmiş restriksiyon endonükleaz enzimleri yardımı ile kesilerek farklı uzunluktaki DNA fragmentleri elde edilir.

3. Agaroz Jel Elektroforezi;

Elde edilen DNA parçaları agaroz jel elektroforezinde yürütülür ve DNA fragmentlerinin birbirinden ayrılması sağlanır. Agaroz jel ayırma görevini üstlenir ve fragmentlere büyüklüklerine göre hareket olanağı sağlamaktadır. Küçük olan DNA fragmentleri daha önde giderken, büyük olan DNA fragmentleri daha yavaş hareket eder ve orijine daha yakın bulunurlar.

4. Southern Blot Düzeneğinin Hazırlanması;

Agaroz jel üzerinde bulunan DNA parçaları bazik olan bir solüsyon içinde bekletilerek denatüre olmaları sağlanır. Böylece DNA parçaları tek zincirli hale geçerler. Tek zincirli DNA’lara Southern Blot uygulanabilmektedir. Southern blot düzeneği tampon bulunan bir sıvı içinde altta tamponu geçirebilen bir sünger, onun üzerinde DNA’nın yürüdüğü agaroz jel, üzerinde ise DNA’nın aktarılacağı naylon membran ve en üstte suyu kendine doğru çekebilen kağıt peçeteler bulunmaktadır.

DNA parçalarının naylon membrana aktarılması işlemi; öncelikle naylon membranın üzerine konan kağıt peçeteler suyu kendine doğru çeker ve bu esnada agaroz jel üzerinde bulunan DNA parçaları tampondaki NA+ iyonlarının etkisi ile naylon membrana doğru itilir. (+) yüklü olan membran (-) yüklü DNA parçalarını kendine bağlar. Böylece DNA naylon membrana aktarılmış olur.

5. Radyoaktif Probla İşaretleme;

DNA’da komplementeri bulunan yaklaşık olarak 2kb büyüklüğündeki problar radyoaktif madde ile ( Radyoaktif S35 içindeki bekletilerek) ile işaretlenir.Radyoaktif olarak işaretlenmiş problar hibridizasyon torbası içine DNA parçalarını içeren naylon membranla birlikte konup 68° C’de su banyosunda bekletilir. Bu süre içinde radyoaktif işaretli problar DNA üzerinde ki komplementer bölgelerle hibridizasyon yaparlar. Bağlanamayan problar ise yıkanarak ortamdan uzaklaştırılır. Böylece tek radyoaktivite hedef DNA bölgesinde kalır.

6. Otoradyografi İle Tesbit;

Son olarak yıkanmış naylon membran ışık geçirmeyen bir kaptaki X ışını film tabakasının üzerine yerleştirilir. Işıma yapan bölgeler radyoaktif hibridizasyon yapmış hedef bölgeler olarak adlandırılmaktadır.

Şevval ÇAKIR

 

Kaynakça;

1. turkpath.org.tr/pdf/7kasim/gaye_guler_tezel_molekuler2.pdf
2. yunus.hacettepe.edu.tr/~coner/GEN/07/sout1.htm
3. merriam-webster.com/dictionary/Southern%20blot